Чем разводить лидазу для электрофореза: Лидаза инструкция по применению, цена, отзывы об уколах. электрофорез с лидазой

Содержание

Электрофорез с Лидазой. Узнать больше о Электрофорез с Лидазой. Жмите.

Электрофорез с Лидазой

Электрофорез с лидазой

В данной статье изложены особенности применения метода лекарственного электрофореза с лидазой, его плюсы и минусы, показания и противопоказания. Также рассматриваются методики применения данного метода лечения с современными препаратами. Электрофорез – популярная физиотерапевтическая процедура, при которой лечебного эффекта достигают за счет постоянного тока-проводника в сочетании с лекарственными препаратами. Одним из таких препаратов является лидаза – ферментное вещество, выделяемое из семенных желез крупного рогатого скота. С помощью таких аппаратов для электрофореза, как Элфор, Элфор-Проф и ПоТок, лидаза доставляется непосредственно в очаг заболевания. Там она оказывает лечебное действие, уменьшая вязкость гиалуроновой кислоты, улучшая движение жидкостей в пространствах между тканями и проницательность сосудов, устраняя отечность. Также электрофорез с лидазой позволяет уменьшить контрактуру, увеличить объем движений суставов и предотвратить развитие новых контрактур.

Приборы для электрофореза с Лидазой

Сортировка: Без сортировкиПопулярныеНовинкиСначала дешевлеСначала дорожеПо размеру скидкиВысокий рейтингНазванию, по возрастаниюНазванию, по убыванию

Всего найдено: 8

Аппарат Элфор – это портативная версия профессионального аппарата для гальванизации и электрофореза Элфор-Проф. Устройство спроектировано специально для домашнего применения, а благодаря маленькому весу и возможности работать от портативного источника питания (6F22 «Крона» 5-10 процедур) позволяет использовать его находясь в дороге или отпуске.

Аппарат для гальванизации и электрофореза Элфор-Проф может использоваться врачом при вызове на дом к пациенту. Также аппарат широко используется в амбулаториях, стационарных лечебных корпусах, SPA-салонах, прочих лечебно-профилактических учреждениях. Причина столь широкого распространения – простота и удобство в применении, надежность и высокая функциональность.

Хит

Скидка 1 000 р.

ПоТок – современный аппарат для электрофореза и гальванизации, используемый в электротерапии. Аппарат позволит проводить физиотерапевтические процедуры в домашних условиях, его применение не имеет возрастных ограничений. Он актуален в педиатрии, имеет плавную регулировку тока, маленький шаг и максимальную защиту от разрывов электрической цепи. ПоТок – логическое продолжение ряда препаратов для электрофореза, выпускаемых с 2003 года.

Хит

Скидка 1 000 р.

Универсальный аппарат для гальванизации и электрофореза «Элфор-Плюс» предназначен для домашнего электрофореза и гальванизации и представляет собой золотую середину между моделями «Элфор» и «Элфором проф». При этом «Элфор-Плюс» может работать с самыми большими электродами – абсолютно без ограничений. Он легко настраивается и позволяет значительно ускорить восстановительные процессы в организме, а также снизить воспаление тканей и мышц. Как в сочетании с лекарственными препаратами, так и без них, «Элфор-Плюс» оказывает мощное лечебное действие и не имеет побочных эффектов, что очень важно для ослабленных больных.

Хит

Скидка 1 000 р.

Новинка

Аппарат Элфор – это портативная версия профессионального аппарата для гальванизации и электрофореза Элфор-Проф. Устройство спроектировано специально для домашнего применения, а благодаря маленькому весу и возможности работать от портативного источника питания (6F22 «Крона» 5-10 процедур) позволяет использовать его находясь в дороге или отпуске.

Хит

Скидка 1 190 р.

Аппарат Элфор-Плюс – это портативная версия профессионального аппарата для гальванизации и электрофореза Элфор-Проф. Устройство спроектировано специально для домашнего применения, а благодаря маленькому весу и возможности работать от сети 220В позволяет не прерывать процедуры в дороге или отпуске.

Хит

Скидка 1 000 р.

Аппарат Элфор-Проф – это профессиональная версия аппарата для гальванизации и электрофореза.

Хит

Скидка 1 000 р.

Аппарат ПоТок – это профессиональная версия аппарата для гальванизации и электрофореза.

Хит

Скидка 1 000 р.

Показания

Электрофорез с лидазой показан к применению при воспалительных изменениях в суставах, заболеваниях женской мочеполовой сферы, заболеваниях органов желудочно-кишечного тракта, нарушениях и дегенеративных изменениях в опорно-двигательном аппарате, спаечных процессах, контрактурах (в том числе, Дюпюитрена), офтальмологических заболеваниях, воспалениях дыхательных путей, гематомах и склеродермии.

Противопоказания

Применение электрофореза с лидазой запрещено при беременности и грудном вскармливании, острых инфекционных процессах, онкологических заболеваниях, бронхиальной астме, тяжелых пороках сердечно-сосудистой системы, нарушении свертываемости крови и склонности к кровотечениям. Также процедура противопоказана людям с индивидуальной непереносимостью или повышенной чувствительностью к электрическому или гальваническому току.

Применение с Ферменколом

Электрофорез с набором «Ферменкол» позволяет легко и быстро выполнить высокоэффективную энзимную чистку за счет своей высокой коллагенолитической активности. Она, в свою очередь, расщепляет рубцовую ткань, состоящую из избыточного коллагена, благотворно воздействуя на весь внеклеточный рубцовый матрикс. В результате происходит безболезненное разрушение и рассасывание капсулы рубца с последующим очищением и регенерацией воспаленной кожи, которую окружала эта капсула.

Применение с Карипаином

Электрофорез с сухими бальзамами «Карипаин» и «Карипаин Плюс», состоящими из натуральных растительных компонентов, позволяет быстро купировать острое, и устранить хроническое воспаление. Протеиназы в их составе значительно ускоряют регенерацию тканей одновременно с метаболическими процессами в организме. Данные препараты в сочетании с электрофорезом излечивают келоидные рубцы, восстанавливают хрящевую ткань и избавляют от межпозвоночных грыж.

Электрофорез с лидазой для детей

АНМО «Ставропольский краевой клинический консультативно-диагностический центр»:

355017, г. Ставрополь, ул. Ленина 304

(8652) 951-951, (8652) 35-61-49 (факс)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (справочная служба)

Посмотреть подробнее

Обособленное подразделение «Диагностический центр на Западном обходе»:

355029 г. Ставрополь, ул. Западный обход, 64

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (контактный телефон)

(8652) 31-68-89 (факс)

Посмотреть подробнее

Клиника семейного врача:

355017 г. Ставрополь, пр. К. Маркса, 110 (за ЦУМом)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (контактный телефон)

(8652) 31-50-60 (регистратура)

Посмотреть подробнее

Невинномысский филиал:

357107, г. Невинномысск, ул. Низяева 1

(86554) 95-777, 96-127, 95-873 (регистратура)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение в г. Черкесске :

369000, г. Черкесск, пр-т. Ленина, 85А

+7-988-700-81-06 (контактные телефоны)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение в г. Элисте :

358000, г. Элиста, ул. Республиканская, 47

8(989) 735-42-07 (контактные телефоны)

Посмотреть подробнее

ЗАО «Краевой клинический диагностический центр»:

355017 г. Ставрополь, ул. Ленина 304

(8652) 951-951, (8652) 35-61-49 (факс)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (справочная служба)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение на ул. Доваторцев, 52А:

355037, г. Ставрополь, ул. Доваторцев, 52А

8 (8652) 316-845 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение на ул. Савченко, 38 корп. 9:

355021, г. Ставрополь, ул. Савченко, 38, корп. 9

8 (8652) 316-847 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение на ул. Чехова, 77 :

355000, г. Ставрополь, ул. Чехова, 77

8(8652) 951-943 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

Обособленное структурное подразделение в г. Михайловске:

358000, г. Михайловск, ул. Ленина, 201 (в новом жилом районе «Акварель»).

8(988) 099-15-55 (контактный телефон)

Посмотреть подробнее

ФИЗИОТЕРАПИЯ ДЛЯ КОСМЕТОЛОГИИ | Пансионат имени А.И. Майстренко

1.Лечение контрактур, келоидных, послеоперационных,

послеожоговых рубцов:

-Фонофорез с ферменколом или  контратубексом или карипаин- кремом на область рубца. Контактно, лабильно.0,4-0,6 Вт/см2 ; на область лица 0,2-0,4 Вт/см2, режим непрерывный 15 минут, № 20

-Электрофорез  Карипаина(+) 1 флакон Карипаина разводится в 5–10 мл физиологического раствора непосредственно перед процедурой. В раствор добавляется 2–3 капли Димексида. Раствор наносится на фильтровальную бумагу белого цвета, размещенную на прокладках электрода. Размеры электрода-прокладки 10 х 15 см. Сила тока 3-5 мА,Время 15-20 мин .Курс 20-30 процедур. В течении года 2-3 курса

-Электрофорез Лидазы(+)  64 Ед с кислотным буфером. Раствор наносится на фильтровальную бумагу белого цвета, размещенную на прокладках электрода.  Сила тока 3-5 мА, Время 15-20 мин .Курс 20-30 процедур. В течении года 2-3 курса.

Между курсами рубец смазывается одним из дефиброзирующих средств.

-Лазеротерапия «РИКТА»

Для предупреждения образования рубцов, через 10 дней после снятия швов.

Обработка проводится на дистанции 0,5-1 см. Скорость сканирования 1 см в секунду. Начинать следует с воздействия на окружающие рану “здоровые” участки кожи, постепенно приближаясь к центру раны. Для усиления эффекта лечения лучше дополнительно проводить чрез кожное воздействие на кровь в регионе, максимально приближенном к зоне поражения.

 Требуемое число процедур- до 7-10 на курс, по 1 процедуре в день. После каждой процедуры можно применять традиционные повязки. При неполном заживлении можно провести повторный курс с интервалом в 1 месяц.

2.ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОЖИ:

-Дарсонвализация. Методика дистантная лабильная. Грибовидный электрод на расстоянии 1-2 см медленными круговыми движениями перемещают вдоль морщин в направлении ото лба к спинке и крыльям носа и нижней челюсти, огибая угол рта и уплотнения тканей. Используют искровой разряд средней мощности. Продолжительность процедуры 5-12 минут. Ежедневно. По мере привыкания интенсивность и продолжительность увеличивается. Курс 8-12 процедур. Повторный курс можно назначить через месяц.

-Лазеротерапия «Рикта».

 Косметические процедуры в области лица и шеи проводятся сканирующим методом вдоль линий на частоте 50 Гц.

Воздействие в области лица проводится в течение 10 минут, в области шеи 5 минут. Начинать сканирование необходимо с задней поверхности шеи по направлению к плечам и в область лопаток.

Следует обратить внимание на то, что при имеющемся заболевании щитовидной железы процедуры в области шеи противопоказаны.

Необходимо отметить, что все косметические процедуры нужно проводить на чистой, сухой коже до наложения кремов.

Противопоказано одновременное проведение лечения заболеваний волос и кожных покровов лица и шеи, т.к. общее время воздействия в области головы не должно превышать 10 минут.

-Витамин Е— электрофорез на область морщин. Один электрод размером 4х6 см смоченный в 0,5 мл 2% р-ра витамина Е , растворенного в 25% растворе ДМСО, помещают в области морщин на лице и соединяют с анодом (+), катод (-) размещают на заднешейный отдел. Сила тока 1-2 мА. Время 20 минут. Курс до 30 процедур. 2-3 раза в год.

-Лидаза-электрофорез, используют полумаску Бергонье с вырезанной по форме фильтровальной бумагой. Смачивают раствором лидазы (+) (0,1 г на 30 мл дистиллированной воды ,подкисленной до рН 5,0-5,2) помещают на одну половину лица, под бумагу смоченную водой и отжатую прокладку. Сила тока 3-5 мА. Время процедуры 15 минут. На следующий день на другой половине лица. Курс 18-20 процедур.

3.ВЫПАДЕНИЕ ВОЛОС,АЛОПЕЦИЯ:

-Дарсонвализация волосистой части головы, Используют гребешковый электрод, контактно, лабильно от лба к затылку. Мощность малая. Ежедневно или через день. Курс 15-20 процедур.

-Электрофорез кальция хлорида 5% (+) на шейно-воротниковую зону. Катод (-) на поясничной области. Сила тока 3-5 мА, время 15 минут. №10-12 ежедневно.

—ЛАЗЕРОТЕРАПИЯ «Рикта»:

 Лечение проводится сканирующими движениями со скоростью 1 см в секунду с максимальным приближением излучателя к поверхности кожных покровов волосистой части головы (1).

Оптимальным при этом является использование излучателя типа ДУШ-2 (лазерная расческа). На правление движений представлены на рисунке . Все время воздействия в области головы не должно превышать 10 минут. Частота воздействия 1000 Гц.

В качестве дополнительной терапии необходимо проводить неинвазивное воздействие на кровь в области пульсации сонных артерий (2) по 2 минуты с каждой стороны на частоте. Для достижения желаемого эффекта необходимо проведение 3-6 курсов терапии по 15 сеансов в каждом.

-Электрофорез никотиновой кислоты 1% (-) на шейно-воротниковую зону. Анод (+) на поясничной области. Сила тока 3-5 мА, время 15 минут. №10-12 ежедневно.

 4. ПИОДЕРМИЯ,АКНЕ:

Не используют при остром и осложненном течении заболевания.

-КУФ — локальное облучение.С 1 биодозы +1/2 биодозы до 2 биодоз, № 5 через день.

-Лечение акне должно проходить параллельно с Универсальной Реабилитационной Программой (УРП), так как это заболевание чаще является следствием гормональной перестройки.

   После проведения УРП осуществляется местное лечение сканирующим методом над пораженными участками на частоте 50 Гц. Время воздействия: лицо — до 10 минут, грудь — 10 минут, спина — 10 минут. Необходимо проводить от одного до трёх курсов по 10-12 сеансов.

 

Методика электрофореза карипаин сухой бальзам

Подготовка электродов

Смочить многоразовые фланелевые прокладки теплой водой 37-39 °C и отжать. Фланелевые прокладки с токопроводящей углеродной тканью следует использовать совместно с резиновыми токопроводящими электродами, которыми оснащены все современные физиотерапевтические аппараты гальванизации и электрофореза. Для старых аппаратов с свинцовыми электродами необходимо использовать гидрофильные прокладки без токораспределительного слоя углеродной ткани.

Подготовка раствора

Ввести шприцом во флакон «Карипаин сухой бальзам» 10 мл. физраствора. Физраствор желательно предварительно подогреть до температуры 36-37°C.

Нанесение раствора на положительный электрод

Открыть колпачок флакона «Карипаин сухой бальзам» и добавить в него пипеткой две капели «Димексид» или шприцом 0,5 мл. После чего вылить подготовленную субстанцию на одну из фланелевых прокладок. В случает отсутствия в наличии «Димексид» — можно исключить его из процедуры.

Нанесение «Эуфиллин 2,4%» на отрицательные электроды

На другие прокладки нанести шприцом 10 мл. «Эуфиллин 2,4%». В случае отсутствия «Эуфиллин», вместо него допускается использование 10 мл. физраствора.

Подготовка к процедуре электрофореза

Вставить резиновые электроды в технический разрез прокладок соблюдая полярность. Два резиновых электрода с красным проводом в одну прокладку с растровом «Карипаин сухой бальзам», и по одному резиновому электроду с синим проводом в прокладки с растровом «Эуфиллин».

Установка времени и силы тока

Установить таймер процедуры на 15-20 минут и регулятором тока выставить значение в диапазоне от 0,5 мА до 15 мА. в зависимости от ощущений пациента. Повышать ток необходимо плавно, опираясь исключительно на ощущения пациента (повышать ток до легкого покалывания). Прокладки должны плотно прилегать к телу пациента, это поможет исключить точечный контакт, в области которого могут появиться микроожоги.

Курсовое лечение

Процедуры лекарственного электрофореза необходимо делать ежедневно и систематически. Количество курсов зависит от степени тяжести заболевания (чаще всего 2-3 курса). Количество процедур лекарственного электрофореза в одном курсе лечения зависит от локализации заболевания. Заболевания позвоночника (протрузия, межпозвоночная грыжа) — курс 30 процедур. Заболевания суставов (артроз, артрит) — курс 10 процедур.

Общие рекомендации

Процедуры выполняются ежедневно, без пропуска. Процедуры электрофореза желательно проводить вечером за 1-2 часа до сна. После процедуры электрофореза необходимо протереть кожу водно-спиртовым раствором или влажной гигиенической салфеткой. Нанести массирующим движением 2-3 г. «Карипаин ультра гель» на зону, где располагалась прокладка с «Карипаин сухой бальзам», после чего отдохнуть 10-15 минут в расслабленном состоянии в тепле. Утром необходимо также нанести 2-3 г. «Карипаин ультра гель». На случай пропуска процедур электрофореза, необходимо продолжать лечение «Карипаин ультра гель». 2 раза в день. (утром и вечером).

Схемы расположения электродов

показания к применению, проведение процедуры в домашних условиях

Электрофорез является физиотерапией, применяемой при различных патологиях. Суть процедуры состоит в том, что медицинское средство проникает сквозь слизистые в кожу при помощи электрического тока. Для того чтобы провести электрофорез, нужен определенный аппарат и лекарство Лидаза, которое увеличивает проницаемость капилляров. Основным плюсом этой методики является то, что ее можно применять не только в поликлинике, но и в домашних условиях.

Суть процедуры

Благодаря электрофорезу с Лидазой происходит электролитическая диссоциация, благодаря которой в водном растворе вещества разлагаются на ионы. Частицы начинают хаотично перемещаться и попадать в организм больного. В лимфе или в крови лекарственное средство начинает постепенно проникать и всасываться в тканях организма. Максимальное количество вещества распределяется в необходимой области, например, в зоне ушей.

Сила тока, возраст пациента, состояние больного, размер ионов и концентрация лекарственного вещества влияют на уровень всасывания.

Благодаря действию электрофореза происходит успокаивающая, обезболивающая, противовоспалительная активность. В период проведения процедуры:

  • системы и органы насыщаются биологическими добавками;
  • нормализуется питание тканей организма и крови;
  • улучшается кровоток.

Основные преимущества

Основным преимуществом при использовании электрофореза является то, что распределение медицинского вещества происходит безболезненно, медленно, эффективно. На проведение процедуры необходимо намного меньше дозировки, чем при внутривенном или внутримышечном введении.

Применение вещества в большой дозе не влияет на эффективность терапии.

Процедура не имеет побочных явлений и неприятных ощущений в момент ее проведения. В отличие от внутривенного или внутримышечного введения кожный покров остается целым. Именно из-за этих достоинств специалисты назначают физиолечение для терапии разнообразных заболеваний. Этот доступный и простой метод снижает дозировку вводимого лекарства и уменьшает риск развития побочных явлений.

Показания и противопоказания

Электрофорез с Лидазой показан при любых воспалительных заболеваниях уха, в том числе и при экссудативном отите. Как и иные медицинские процедуры, электрофорез имеет показания, ограничения и противопоказания к применению. На них необходимо обращать внимание и учитывать при проведении процедуры в домашних условиях.

Противопоказаниями к процедуре являются такие состояния, как:

  • тяжелая форма воспалительных процессов;
  • наличие опухолей;
  • гиперчувствительность к элементам, входящим в состав лекарственного средства;
  • порок сердца;
  • бронхиальная астма;
  • внутреннее кровотечение;
  • период вынашивания ребенка и грудного вскармливания;
  • нарушение свертываемости крови.

При электрофорезе применяют ток разного типа:

  • флюктуирующий;
  • выпрямленный;
  • гальванический;
  • диадинамический.

Только лечащий врач определяет и назначает вид тока.

При проведении электрофореза с Лидазой на уши в домашних условиях необходимо заранее проконсультироваться со специалистом.

Воздействие электрофореза

Терапия ушных заболеваний электрофорезом с Лидазой практически не вызывает побочных явлений и является безболезненной процедурой. Чаще всего среди ЛОР-заболеваний встречаются воспалительные процессы в ухе. При назначении электрофореза предотвращается развития осложнений в виде:

  • менингита;
  • поражения сосудов;
  • сепсиса;

Кроме того, ускоряется выздоровление пациента. Если воспалительный процесс в ушах проходит в острой форме, то назначают эндоназальные терапии, то есть введение электрофореза с Лидазой через нос. При хроническом виде заболеваний показан эндауральный тип лечения.

В период процедуры колебания проходят только через человеческое тело, при этом оказывается влияние на внутренние органы и ткани организма. Из-за такого воздействия повышается кровоток и начинают активно вырабатываться лейкоциты.

Довольно высокой эффективностью обусловлено частое назначение электрофореза с Лидазой при ушных патологиях.

Если есть большое количество гноя или запущенная форма болезней в ухе, срок терапии составляет не менее 14 сеансов.

Методика проведения

Методика проведения процедуры как в медицинских учреждениях, так и в домашних условиях не отличается:

  1. Для начала специалист назначает определенные подготовительные мероприятия индивидуально каждому пациенту в зависимости от степени воспаления ушей.
  2. Лидазу разводят в дистиллированной воде. Получается лечебный раствор с концентрацией 2–4%. Если препарат не растворяется в воде, то используют диметилсульфоксид.
  3. Пациенту необходимо находиться в лежачем положении в период проведения процедуры.
  4. Электроды предварительно смачивают в терапевтическом растворе и прикладывают их или вставляют в ушной канал. Если электрод нужно зафиксировать, то применяют специальные фиксирующие повязки. 15 мА является максимальной силой электрического тока. Основным плюсом методики считается то, что пациент не ощущает дискомфорта.
  5. Длительность процедуры составляет не более 20 минут.

Электрофорез с Лидазой на уши можно провести не только в поликлинике, но и в домашних условиях. Пациент должен соблюдать инструкцию по применению и следовать указаниям специалиста.

Лекарственное средство НПО Петровакс Фарм Лонгидаза — «Лонгидаза, Лидаза, Алоэ(экстракт)+физио+противоспаечный гель во время операции… Ударим по спайкам всей артиллерией…»

В 2017 году у меня обнаружили инстерцио-субмукозную миому, которая растет в полость матки, как спираль и не дает забеременеть… После принятия контрацептивов Ригевидон(о принятии и последствиях после принятия ок можно прочитать здесь), обнаружился рост миомы, нужно было срочно удалять, но перед этим меня посадили на БУСЕРЕЛИН-ДЕПО, ввели в искуственный климакс, для уменьшения миомы, чтобы шов на матке был меньше… Об этом можно почитать тут…

Начался поиск методов удаления, на консилиуме врачей было решено удалять лапароскопически… Оперирующий врач предложила мне купить любой гель против спаек, чтобы его влить в оперируемую полость… Ну сказано, сделано… В нашем городе продается только в одной аптеке Мезогель и Антиадгезин… Мезогеля не оказалось, соответственно выбор пал на Антиадгезин…( вот ссылочка на противоспаечный гель Антиадгезин… Противоспаечный гель… Чуда не случилось…)

Операция прошла, гель влили… Где-то через нелели 2-3 у меня начались боли тянущие слева, в районе яичника.. Боли не прекращались… Ставилось то лучше, то опять все возвращалось на прежний уровень..

Прошла я УЗИ послеоперационное, матка оказалось чуть отклонена влево, что косвенно указывает на спаечный процесс…

Вот тут я решила, что нужно действовать… Пришла на прием в своему врачу и начала выпрашивать назначения на физиопроцедуры, такие как:

1. Магнитотерапия

2. Ультратон

3. Ультразвук

Просила назначить мне противоспаечную терапию… Вот собственно о чем сейчас и пойдет речь)))) Простите за длинное вступление))

Назначения врача _ Лонгидаза 1 свечка через 2 дня, курс 20 штук…

Лидаза — электрофорез на низ живота(но будьте осторожны, если у вас есть признаки эндометриоза, категорически нельзя, т.к.под импульсами электрофореза все очаги разрастутся!!! Курс из 10 процедур

Лидаза уколы внутримышечно, 10 штук, после электрофореза, каждый день, разводить натрием хлоридом 0.9%- 1ml…

Алоэ, экстракт жидкий, 20 штук, каждый день, разводить не нужно…

Теперь перейдем к делу… ЛОНГИДАЗА…

Активное вещество: Бовгиалуронидаза азоксимер (Лонгидаза®) – 3000 МЕ
Вспомогательное вещество: масло какао – до получения суппозитория массой 1,3 г

Чуть выше я показала как выглядит свеча, она имеет приятный запах какао. Применять только после опорожнения кишечника, тогда будет толк…

В совокупности мне стало намного легче, тянуть низ живота перестало…

Я решила, что нужно действовать, не жалеть денег, т.к. если ничего не делать, то и результата не будет…

Всем удачи в борьбе со спайками…

Поставлю пока что 4, т.к. не знаю снялись только симптомы или же спайки рассасываются!!! Дополню отзыв после очередного УЗИ…

Возможно Вам будет интересно)

Ригевидон — гиперлазия молочных желез… Ужасные побочки

Как я лечу грудь после приема ОК…

Как я лечу грудь после приема ОК… Прожестожель… Либидо ноль…

Как я лечу грудь… Мастопол.. после отмены боль вернулась, не такая сильная, но ощутимая…

 

Антиадгезин… Противоспаечный барьер.. Чуда не случилось

Бусерелин-Депо… Помощь в борьбе с миомой… На пути рождения бейбика)

 

Полижинакс+Фемилекс — моя панацея против бак.вагиноза

Подольск Medical On Group Подольск

Для полного выздоровления пациента и минимизации последствий перенесенной болезни, очень важно не пренебрегать этапом реабилитации. При пневмонии вирусной этиологии, и особенно вызванной новой коронавирусной инфекцией, серьезная нагрузка идет на весь организм. Конечно, в первую очередь, страдают легкие и различные мероприятия (что очень важно) позволяют в той или иной степени восстановить легочную ткань, ускорить ее регенерацию. Также идет большая нагрузка на опорно-двигательный аппарат. Длительное положение лежа создает дополнительную нагрузку, способствует спазматике одной группы мышц и ослаблению другой. При новой коронавирусной инфекции негативному воздействию может подвергнуться также сосудистая система. И не стоит забывать про интоксикацию организма, вызванную вирусом.
Конечно, все реабилитационные мероприятия, должны подбираться индивидуально, в зависимости от того, как протекала болезнь, и от текущего состояния пациента. Но в этой статье приводится наиболее универсальный вариант курса, направленный на восстановление именно отдела легких. Причем, мы опосредованно воздействуем и на легочную ткань, и на мускулатуру (включая часть сосудистой системы), и на лимфатическую систему локально (что способствует деинтоксикации).

КУРС состоит из процедур физиотерапии, массажа и ЛФК.

 

I. Физиотерапия:

Электрофорез лидазы на область легких

методика: положение пациента лежа

а) два одинаковых электрода площадью 150-200 см² каждый распологают по средней подмышечной линии справа и слева, присоединяют к разным полюсам. Тогда за время процедуры элктроды меняют местами, дополнительно на прокладку с анодом (-) при смене электрода добавляют лидазу.. Проводят по 10 мин. на каждое положение (рис. а).

б) три одинаковых электрода площадью 150-200 см² помещают: первые два раздвоенные электроды на область нижних отделов легких со стороны спины и подсоединяют к аноду (-), с этих электродов вводят лидазу, третий электрод располагают в области грудины, и подсоединяют к катоду (+) (рисунок отсутствует).

Сила тока составляет 10-15 мА, продолжительность 15-20 мин. Процедуры проводят ежедневно, либо через день. На курс 10-15 процедур. Лекарственное вещество можно вводить с разных полюсов.

Разведение лидазы: 64 МЕ (1 амп.) на 30 мл дистиллированной воды, подкисленной до Рн 5,0-5,2. Вводится с анода (-).

Магнитотерапия области легких

Два цилиндрических индуктора устанавливают вначале на область проекции корней легких (на уровне 4-7 грудных позвонков) – 1 поле, а затем нижних отделов легких с охватом проекции надпочечников (на уровне 9 грудного и 1 поясничного позвонков – 2 поле разноименными полюсами друг к другу, направленность магнитных силовых линий – перпердикулярная (горизонтальная) по отношениюк оси тела или позвоночника. Ипользуют пульсирующее магнитное поле, непрерывный или прерывистый режимы, частота 10 Гц, интенсивность магнитной индукции 10-16 мТл.

Продолжительность воздействия составляет по 10-15 мин. на каждое поле. Процедуры проводят 4-6 раз в неделю. На курс лечения назначают по 10-20 процедур.

Ультразвуковая терапия области легких

Проводят на 3 зоны.

— Первая зона – два паравертебральных поля грудного отдела позвоночника (справа и слева) на уровне позвоночника Th2-Th22. Интенсивность 0,2 Вт/см², режим непрерывный или импульсный. Положение пациента – сидя на стуле лицом к спинке стула, руки согнуты в локтевых суставах и положены на спинку стула, подбородок упирается в руки.

— Вторая зона – область 6-7 или 7-8 межреберий, начиная от паравертебральной линии до средней подмышечной. Интенсивность 0,4 Вт/см², режим непрерывный или импульсный, методика лабильная, способ контактный по 2 мин. справа и слева.

— Третья зона – подключичная область от грудино-ключичного сочленения до плечевого сустава справа и слева. Интенсивность 0,2 Вт/см², режим непрерывный или импульсный, методика лабильная, способ контактный по 1 мин. справа и слева. Положение пациента – лежа на спине или сидя на стуле лицом к человеку, проводящему процедуру.

Воздействие на 1-ю зону проводят в первый день.

Во второй день воздействуют на 1-ю и 2-ю зоны.

В третий день последовательно озвучивают все три зоны.

8-10 процедур проводят ежедневно, затем через день.

На курс лечения назначают 12-15 процедур.

     Для усиления дефиброзирующего эффекта можно использовать лидазу под гель, нанося ее на каждую зону (ультрафонофорез лидазы).

Разведение лидазы: р-р 1 амп. лидазы 64 МЕ растворяют в 1 мл. 0,5% р-ра новокаина. Наносят на одну зону шприцом, затам растирают стекляной палочкой или пальцем, покрывют данный участок тонким слоем геля для ультразвука (глицерина, вазелинового масла).

P.S. каждая зона в методике разделена на две подзоны – правая и левая. Значит р-р лидазы наностися на каждую подзону по одной ампуле. Итого на процедуре 6 подзон, значит за одну процедуру понадобится 6 амп. лизазы и 6 мл р-ра новокаина + плюс гель.

В КУРС РЕАБИЛИТАЦИИ ВОЙДУТ ДВЕ ПРОЦЕДУРЫ (на усмотрение врача, с учетом противопоказаний):

 

1. Электрофорез лидазы и магнитотерапия

ИЛИ

2. Ультразвуковая терапия области легких и магнитотерапия.

 

СОЧЕТАНИЕ ЭЛЕКТРОФРЕЗА И УЛЬТРАЗВУКА НА ОДНУ ЗОНУ В ОДИН ДЕНЬ ДЕЛАТЬ НЕ РЕКОМЕНДУЮТ.

 

II. Массаж гружной клетки по классической лечебной методике.

 

III. ЛФК

 

Примерный комплекс упражнений:

 

Задачи ЛФК при пневмонии:

  • максимально воздействовать на здоровую легочную ткань для включения ее в дыхание;

  • усилить крово- и лимфообращение в пораженной доле;

  • противодействовать возникновению ателектазов.

Задачи ЛФК при остром бронхите:

  • уменьшить воспаление в бронхах;

  • восстановить дренажную функцию бронхов;

  • усилить крово- и лимфообращение в системе бронхов, спо­собствовать профилактике перехода в хронический бронхит;

  • повысить сопротивляемость организма.

 

Комплекс № 1. Упражнения для больных острой пневмонией и бронхитом.

(постельный режим с 3-5-го дня)

Упражнения проводят в медленном и среднем темпе, каждое повторяют 4-8 раз с максимальной амплитудой движения.

Продолжительность процедуры — 10-15 мин; самостоя­тельные занятия — по 10 мин 3 раза в день.

ИП — лежа на спине

1.        Диафрагмальное дыхание, руки для контроля лежат на груди и жи­воте.

2.        На вдохе поднять руки вверх, на выдохе — опустить. Выдох вдвое длиннее вдоха.

3.        На вдохе отвести прямую ногу в сторону, на выдохе вернуться в ИП.

4.        Руки согнуты в локтях. На вдохе руки развести в стороны, на выдохе руки опустить.

5.        На вдохе руки развести в стороны, на выдохе колени подтянуть к животу руками.

ИП — лежа на боку

6.        На вдохе руку отвести назад с поворотом туловища назад, на выдо­хе вернуться в ИП, руку положить на эпигастральную область.

7.        Руку положить на нижние ребра, на вдохе, надавливая на нижние ребра ладонью, создать сопротивление.

8.        Ладонью охватить шею сзади, создав статическое напряжение мышц плечевого пояса. При выполнении глубокого дыхания «ак­цент» приходится на нижнюю долю.

Закончить комплекс в положении лежа на спине диафрагмальным дыханием.

 

Комплекс № 2. Упражнения для больных острой пневмонией и бронхитом.

(палатный режим, полупостельный с 5-7-го дня)

Увеличивают число повторений предыдущего комплекса каждого упраж­нения до 8-10 раз в среднем темпе. Продолжительность за­нятия 15-30 мин, используют также ходьбу. Занятия повто­ряют самостоятельно. Общая продолжительность занятий в течение дня — до 2 ч.

ИП — сидя на стуле

1.        Диафрагмальное дыхание, руки для контроля лежат на груди и жи­воте.

2.        Руку поднять вверх, наклон в противоположную сторону, на выдохе руку опустить.

3.        Отвести локти назад, вдох, на выдохе вернуться в ИП.

4.        Руками повторять движения пловца брассом. Вдох — в ИП, вы­дох— руки развести в стороны.

5.        На вдохе руки развести в стороны, на выдохе «обнять.» себя за плечи.

ИП — стоя

6.        В руках гимнастическая палка. На вдохе поднять руки вверх, про­гнуться, ногу отвести назад, поставить на носок.

7.        Круговые движения руками — «гребля».

8.        В руках булаву. На вдохе руки в стороны, булавы параллельны по­лу. На выдохе наклон, булавы поставить на пол.

9.        На вдохе поднять руки вверх, на выдохе приседание, руки в упоре о пол.

10.     Палка сзади заведена за локтевые сгибы, на вдохе прогнуться на­зад, на выдохе наклон вперед.

Закончить комплекс в ИП сидя. Общее количество упражнений в процедуре лечебной гимнастики — 20-25.

 

Комплекс № 3. Упражнения для больных острой пневмонией и бронхитом.

(общий режим, с 7-10-го дня (не ранее))

Занятия лечебной гимнастикой аналогичны применяе­мым на палатном режиме, но с большей нагрузкой, вызываю­щей учащение пульса — до 100 уд./мин. Продолжительность одного занятия — 40 мин; применение упражнений, ходьбы, занятий на тренажерах, игр составляет 2,5 ч в день.

ИП — стоя

Ходьба по залу ЛФК, ходьба на носках, пятках, наружной и внутрен­ней стороне стоп (3-5 мин).

1.      Подняться на носки, плечи поднять, пальцы в кулак, на выдохе вер­нуться в И П.

2.      На вдохе руки вверх, голову поднять, прогнуться, на выдохе — при­седание, кисти рук на коленях.

3.      «Насос». На вдохе поочередные наклоны в стороны, рука скользит по бедру вниз. На выдохе вернуться в ИП.

4.      В руках медицинбол, руки перед грудью. На вдохе повороты в сто­роны, на выдохе вернуться в ИП.

5.      Ходьба с высоким подниманием бедра и активной работой рук (3- 5 мин).

6.      ИП —стоя, палка лежит на стуле. Вдох—руки поднять, на выдохе наклониться, взять палку. Следующий вдох с палкой в руках. На вы­дохе палку положить на сиденье.

7.      Стоя боком к гимнастической стенке. Рукой держаться за перекла­дину на уровне груди. На вдохе отклониться от стенки, на выдохе вернуться в ИП.

8.      Стоя лицом к гимнастической стенке. На вдохе поднять руки вверх, тянуться руками к верхней ступеньке, на выдохе руками держаться за перекладину на уровне пояса, легкое приседание.

9.      В руках гимнастическая палка, руки опущены. На вдохе руки вверх, на выдохе колено поджать к животу с помощью палки.

10.     Руки перед грудью, на вдохе руки в стороны, поворот туловища в сторону, на выдохе вернуться в ИП.

Закончить процедуру Л Г ходьбой в среднем темпе с переходом на медленный.

Адаптация капиллярного гель-электрофореза в качестве чувствительного, высокопроизводительного метода для ускорения характеристики ферментов метаболизма нуклеиновых кислот

Abstract

Подробная биохимическая характеристика ферментов нуклеиновых кислот имеет фундаментальное значение для понимания метаболизма нуклеиновых кислот, репликации генома и восстановления. Мы сообщаем о разработке быстрого высокопроизводительного метода флуоресцентного капиллярного гель-электрофореза в качестве альтернативы традиционному электрофорезу в полиакриламидном геле для характеристики ферментов метаболизма нуклеиновых кислот.Принципы дизайна анализа, описанные здесь, могут быть применены практически к любой ферментной системе, которая действует на флуоресцентно меченный олигонуклеотидный субстрат. Здесь мы описываем несколько анализов с использованием этой методологии основного капиллярного гель-электрофореза для ускорения изучения ферментов нуклеиновых кислот. Во-первых, анализы были разработаны для изучения активности ДНК-полимеразы, включая кинетику включения нуклеотидов, синтез замещения цепи и активность экзонуклеазы 3′-5′. Затем отслеживали репарационную активность ДНК-лигазы, лоскутной эндонуклеазы и РНКазы h3.Кроме того, для характеристики специфичности нуклеазы GAN был реализован многоцветный анализ, в котором в одной реакции используются четыре различных флуоресцентно меченных субстрата. Наконец, описан двухцветный флуоресцентный анализ для мониторинга связанных ферментативных реакций во время созревания фрагмента Окадзаки. Эти анализы служат в качестве шаблона для дальнейшего технического развития для характеристики ферментов или скрининга нуклеозидных и ненуклеозидных ингибиторов с высокой пропускной способностью.

ВВЕДЕНИЕ

Метаболизм нуклеиновых кислот, который включает синтез и деградацию ДНК и РНК, является фундаментальным для всех сфер жизни.Ферменты, участвующие в репликации и репарации ДНК, широко изучались более полувека (1). Стандартные методы изучения ферментов нуклеиновых кислот обычно измеряют синтез или деградацию ДНК или РНК путем обнаружения радиоактивно или флуоресцентно меченных субстратов нуклеиновых кислот. Например, было разработано множество простых методов для обнаружения активности ДНК-полимеразы и скрининга ингибиторов. Флуоресцентные красители, связывающие ДНК, оказались полезными для количественного анализа ДНК. Увеличение флуоресценции PicoGreen или EvaGreen при связывании красителя с вновь синтезированной ДНК можно использовать для измерения активности синтеза ДНК-полимеразы (2,3).В качестве альтернативы, активность ДНК-полимеразы можно определить по высвобождению флуоресценции зондов TaqMan, гасящих краситель, или молекулярных маяков (4). Кроме того, активность синтеза ДНК-полимеразы можно контролировать путем обнаружения пирофосфата (PPi) или ионов водорода, которые высвобождаются во время синтеза (5, 6). Необработанные изменения интенсивности флуоресценции меченых олигонуклеотидов можно использовать для мониторинга активности ДНК-полимераз, рестрикционных эндонуклеаз или ДНК-лигаз (7,8). Как эндонуклеаза лоскута (Fen1), так и активность РНКазы H могут быть обнаружены по изменениям поляризации флуоресценции (FP) (9,10) или репортерной системе сопряженного резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) (11,12).Эти простые флуоресцентные методы полезны для высокопроизводительных анализов конечной точки активности и для скрининга ингибиторов ферментов. Однако промежуточные или побочные продукты реакции маскируются, поэтому для получения всестороннего понимания активности ферментов нуклеиновых кислот необходимы альтернативные анализы, которые фиксируют детали пути реакции.

Электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) широко используется для анализа размера и распределения субстратов, промежуточных продуктов и продуктов.Структура и функция многих ферментов нуклеиновых кислот были охарактеризованы с использованием этих стандартных анализов. Несмотря на свою полезность, анализ с помощью ПААГ относительно неэффективен и ограничивает возможности анализа ферментов. Количество образцов и условий, которые можно анализировать на одном геле, ограничено в зависимости от процентного содержания геля и размера подложки. Кроме того, количественный анализ продуктов на гелях PAGE является громоздким и требует ручного сканирования и анализа. Таким образом, анализ с использованием гелей PAGE ограничивает количество реакций, которые можно провести, и условий, которые можно исследовать.

Мы описываем альтернативный метод характеризации ферментов нуклеиновых кислот с использованием высокопроизводительного капиллярного гель-электрофореза. Капиллярный гель-электрофорез (КЭ) представляет собой чувствительную высокопроизводительную систему с высоким разрешением для анализа нуклеиновых кислот (13). При КЭ флуоресцентно меченные нуклеиновые кислоты разделяются по размеру и заряду и обнаруживаются с помощью лазерного возбуждения. Загрузка образцов и сбор данных автоматизированы и выполняются быстро, что позволяет анализировать 96 образцов менее чем за час. Капиллярный гель-электрофорез впервые заменил пластинчатые гели в флуоресцентном секвенировании ДНК по Сэнгеру и ускорил высокопроизводительное секвенирование генома человека (14,15).CE также использовался в качестве аналитического инструмента для анализа полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP), микросателлитного анализа и обнаружения однонуклеотидного полиморфизма (SNP) (16). В этом исследовании мы мультиплексировали дизайн субстрата как по размеру, так и по флуоресцентному цвету, чтобы одновременно анализировать несколько субстратов, продуктов и/или промежуточных продуктов реакции в одной реакции, сокращая время анализа и затраты, связанные с характеристикой ферментов. В дополнение к анализам, описанным здесь, мы также обсудим потенциал метода для обнаружения, характеристики и инженерии ферментов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ферменты, олигонуклеотиды и реагенты

Все модифицирующие ферменты, 9°N m ДНК-полимераза, нуклеотиды и одноцепочечная ДНК M13mp18 (ssM13) были получены от New England Biolabs (NEB, Ипсвич, Массачусетс, США ). 9°N ДНК-полимераза D-экзонуклеаза минус (polD-экзо-) была очищена, как описано ранее (17). Поглощение, испускание, относительная интенсивность и последовательности флуоресцентных красителей олигонуклеотидов перечислены в таблицах и . Олигонуклеотиды были приобретены у компаний Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA, USA) или Life Technologies (Carlsbad, CA, USA).Как правило, субстраты праймер-матрица получали путем отжига флуоресцентно меченого праймера и матрицы (таблица) в буфере 1X ThermoPol (20 мМ Tris-HCl, 10 мМ (NH 4 ) 2 SO 4 , 10 мМ KCl , 2 мМ MgCl 2 , 0,1% Triton X-100, pH 8,8 при 25°C) путем нагревания до 95°C в течение 3 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры.

стол 1.

Таблица 1.

Поглощение красителя Maxima, эмиссионные максимумы и относительные интенсивностей

Dye Absite Max Относительная интенсивность TM 494 нм 494 нм 522 нм 100 РФС ВИК ® 538 нм 554 нм 100 РФС НЭД ТМ 546 нм 575 нм 40 РФС ТАМ 560 нм 583 нм 25 РФС ПЭТ ® 558 нм 595 нм 25 РФС ЛИЗ ® 638 нм 655 нм 50 RFU

Таблица 2.

Олигонуклеотидные подложки

MABECON Sequence
FAM-FEN1 BLAP OLIGO (клапан подчеркнуты) 3′-FAM GTT AGT TCG AGC GTA ATG CCC Tat AGT GAG TCG TAT TAA GGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT GCC AAG CTT GCA TGC CTG CAAG CTT GCA TGC CTG CA- MAM
FEN1 Primer None CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC G
FAM-расширение грунтовки 5′-fam FAM- CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC
TAM-расширение Primer 5′-TAM TAM -CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC
Fam-лигирование ACPECTOR 5′-FAM FAM- CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC
Liging Donor NORE P-GTT GTA AAA CGA CGG CGCA GTG CCA AGC TTG
Strand SageAction Template NOTE GCC GAC CTG CAG GCA TGC AAG CTT GGC ACT GGC CGT CGT TTT ACA ACA ACG TCG TGA CTG GGA AAA CCC TGG CG
Strand Sageaction ДНК блокирует OLIGO NORE GCC AAG CTT GCA TGC CTG CAG GTC GAC
Матрица для включения FAM и экзопраймер 5′-FAM FAM -AGT GAA TTC GAG CTC GGT ACC9 CGG0 GGA CACTG4 GTC4
Регистрация и экзо-шаблон NOTE TTG CTC GTT TGC TGG GAG CCT GCA GGT CGA CTCC TGG AGG ATC CCC GGG TAC CGA GCT CGA ATT CAC T
RNASE H3 OLIGO 3′-FAM RGRCRC RARARG RCRURU RGCA TGC CTG CAG GTC GAC TGC AGA GGA TCC CCG GGT ACC GAG CTC Gaa TT- FAM
Оказаки Фрагмент блокировки грунтовки 3′-FAM RGRCRC RARARG RCRURU RGCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA GGA TCC CCG GGT ACC GAG CTC GAA TT- FAM

Капиллярный гель-электрофорез

Капиллярный гель-электрофорез обнаруживает флуоресцентно меченые продукты реакции, которые разделяются по размеру и заряду по мере их миграции через наполненный полимером капилляр.Образцы CE готовят путем смешивания 10 мкл стандарта размера LIZ, разбавленного 1:40 в формамиде HiDi (Applied Biosystems), и 1 мкл флуоресцентно меченного реакционного образца (от 0,15 нМ до 20 нМ) (18). Реакционный образец и фрагменты стандартного размера электрокинетически вводят в капиллярную матрицу длиной 36 см, заполненную полимером с оптимизированными характеристиками (POP7). Электрофорез высокого напряжения (15 кВ) обеспечивает одноосновное разрешение. Типичные параметры запуска показаны в таблице. Миграция флуоресцентно меченых фрагментов образца и стандартного размера через окно лазера обнаруживается и регистрируется ПЗС-камерой на приборе.Набор фрагментов ДНК, помеченных определенным красителем (LIZ), служит для создания стандартной кривой, которая используется для расчета размера продукта. Например, стандарт размера 120 LIZ включает 15, 20, 25, 35, 50, 62, 80, 110 и 120 нуклеотидных LIZ-меченных фрагментов ДНК. Кроме того, рекомендуется использовать флуоресцентно меченные синтетические субстраты и стандарты продуктов для проверки их положения в анализах КЭ. Все реакции, описанные ниже, разделяли с помощью КЭ с использованием генетического анализатора 3730xl (Applied Biosystems), а флуоресцентные пики анализировали с использованием программного обеспечения Peak Scanner версии 1.0 (Прикладные биосистемы). Генетический анализатор 3730xl выполняет разделение и анализ 96 образцов менее чем за 1 час.

Таблица 3.

Типичные параметры бега для генетического анализатора 3730 XL

0

1

Анализ данных

Технический процесс анализа данных CE обозначен на рисунке . Программное обеспечение Peak Scanner (Applied Biosystems) отображает пиковую интенсивность флуоресценции КЭ и создает файл .fsa с необработанными данными, включая краситель пика, размер, высоту, площадь, а также информацию о начальной и конечной точках пика.Данные файла .fsa можно экспортировать в виде файла значений, разделенных запятыми (.csv), и вручную проанализировать с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами, такого как Microsoft Excel или Apple Numbers. Идентифицируются соответствующие пики данных и извлекаются площади пиков (рис. ). Долю субстрата или продуктов рассчитывают, как показано на рис. При необходимости концентрацию продукта можно рассчитать путем умножения (исходная концентрация субстрата) * (% продукта). Относительные площади пиков из каждого капилляра следует анализировать независимо, поскольку количество вводимой ДНК варьируется между капиллярами из-за различий в эффективности загрузки и условиях буфера.Ручной анализ субстратов и продуктов с использованием Microsoft Excel или другого программного обеспечения для работы с электронными таблицами прост, однако анализ больших наборов данных занимает много времени (> 1 часа анализа на 96 реакций). Для ускорения анализа можно разработать специальные программные инструменты или макросы для быстрого извлечения и анализа больших наборов данных (анализ менее 10 с на 96 реакций) и увеличения пропускной способности. Для окончательного анализа данных данные наносятся на график, а кривые подгоняются с использованием стандартного статистического или графического программного обеспечения.

Рабочий процесс анализа данных капиллярного гель-электрофореза.Рабочий процесс анализа данных CE схематично показан на панелях (A) и (B). ( A ) Флуоресцентные реакции разрешаются и обнаруживаются с помощью КЭ для идентификации пиков субстрата и продукта. Затем определяют площади пиков и рассчитывают доли субстрата и продуктов. ( B ) Программное обеспечение Peak Scanner создает файл необработанных данных CE (.fsa), который можно экспортировать в виде таблицы (файл .csa). Стандартное программное обеспечение для работы с электронными таблицами можно использовать для извлечения пиков и площадей, а также для расчета долей субстратов и продуктов.Затем статистическое графическое программное обеспечение используется для окончательного анализа данных, включая построение графиков и построение кривых.

Общие соображения по плану эксперимента

Анализы, описанные ниже, являются примерами, предназначенными для использования преимуществ чувствительности, гибкости и автоматизации системы капиллярного гель-электрофореза для изучения ферментов нуклеиновых кислот. В этом разделе мы обсудим общие параметры экспериментального дизайна, чтобы максимизировать потенциал системы и любые ограничения, которые следует отметить.Используемые здесь принципы дизайна анализа могут быть применены практически к любой ферментной системе, которая действует на нуклеиновые кислоты. Реакционные субстраты, промежуточные продукты и продукты могут быть помечены с использованием различных красителей-меток, имеющих хорошо разделенные спектры возбуждения и испускания (FAM, TAM или NED, VIC и PET (таблица)). Мультиплексирование олигонуклеотидов по размеру и цвету позволяет проводить одновременный анализ нескольких субстратов, продуктов и/или промежуточных продуктов в рамках одной реакции. Прибор для капиллярного гель-электрофореза 3730xl Genetic Analyzer анализирует до пяти меток красителей (FAM, TAM или NED, VIC, PET и LIZ в качестве стандартного размера) в одном капилляре с использованием набора фильтров G5.Флуоресцентные субстраты можно обнаружить в диапазоне концентраций от <0,01 нМ до 10 нМ. Более высокие концентрации флуоресцентного субстрата (> 10 нМ) насыщают детекторы CE и не могут быть надежно определены количественно.

Интенсивность флуоресценции метки красителя может зависеть от контекста последовательности (7). В частности, нуклеозидные основания на 5′- и 3′-стороне меченого красителем нуклеозида могут влиять на интенсивность флуоресценции. Поэтому, если возможно, при разработке субстратов метки красителя следует размещать в последовательном месте, чтобы минимизировать различия в интенсивности флуоресценции.Кроме того, синтетические контрольные олигонуклеотиды, меченные красителем, имеющие ту же последовательность, что и анализируемые субстраты и продукты, должны использоваться в качестве стандартов в каждом цикле КЭ. Стандарты проверяют как ожидаемое время элюирования, так и относительную интенсивность флуоресценции субстратов, продуктов и промежуточных продуктов.

Нуклеиновые кислоты электрокинетически загружаются на CE. Во время электрокинетической инъекции анионы соли конкурируют с отрицательно заряженной ДНК во время загрузки. Следовательно, по мере увеличения концентрации соли в образце в капилляр будет вводиться меньше ДНК, что приведет к уменьшению флуоресцентного сигнала.Кроме того, в присутствии загрузочного раствора формамида избыток соли может вызвать осаждение ДНК. Поэтому мы рекомендуем снизить концентрацию соли перед инъекцией либо путем разбавления dH 2 O, либо с помощью эксклюзионной колоночной хроматографии. Концентрации соли от 0,25 мМ NaCl до 2 мМ NaCl не вызывали наблюдаемых различий в типичной интенсивности флуоресценции или необычного подавления пиков отдельных продуктов.

Есть несколько других важных ограничений метода КЭ.Нуклеотидный состав и структура флуоресцентного красителя влияют на миграцию олигонуклеотидного фрагмента через капилляр. Миграция очень коротких фрагментов (<10 нт) определяется размером метки красителя и, следовательно, не мигрирует в соответствии с их ожидаемым размером (19). Поскольку реакции смешиваются с формамидом перед загрузкой в ​​CE, ДНК и любые белки будут денатурированы. Следовательно, КЭ не является подходящим методом для анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA).

Анализ активности ДНК-полимеразы

ДНК-полимераза включение одиночных нуклеотидов в предстационарном состоянии отслеживалась путем удлинения флуоресцентно меченого праймера/матрицы (таблица) следующим образом.Экзо- PolD (конечная концентрация 90 нМ), связанный с ДНК-субстратом FAM-праймера/матрицы (конечная концентрация 30 нМ), смешивали с dTTP (конечная концентрация 100 мкМ) в буфере 1X Thermopol с использованием аппарата Rapid Chemical Quench (RQF) (KinTek Corp. ., Сноу-Шу, Пенсильвания). После инкубации при 60°С в течение 0,1–10 с реакции гасили 50 мМ ЭДТА. В качестве контроля матрицу/праймер 5′-FAM инкубировали с dTTP без экзо- polD в RQF. Реакции анализировали с помощью КЭ, как описано выше. Концентрацию продукта наносили на график как функцию времени, и данные подгоняли к одноэкспоненциальному уравнению (1) для получения скорости включения dTTP ( k obs ) с использованием программы нелинейной регрессии Kaleidagraph (Synergy Software).

(1)

Активность замещения цепи ДНК-полимеразы оценивали по удлинению праймера в присутствии или в отсутствие нижележащего блокирующего праймера. Субстрат для смещения цепи готовили, как описано выше, с использованием олигонуклеотидов, перечисленных в таблице. ДНК-полимераза (0,3 ед/мкл T4 или 0,8 ед/мкл Bst, большой фрагмент, конечная концентрация), 15 нМ субстрата для замещения цепи и 0,2 мМ dNTP в 1X буфере ThermoPol инкубировали в течение 30 мин при 25°C или 50°C ( для ДНК-полимераз T4 и Bst соответственно).Реакции останавливали добавлением ЭДТА (конечная концентрация 100 мМ). В качестве контроля 5′-FAM-примированную матрицу инкубировали без полимеразы в качестве стандарта размером 24 нуклеотида. Реакции анализировали с помощью КЭ, как описано выше.

3′-5′-экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы 9°N m тестировали путем мониторинга деградации 5′-FAM-меченого экзопраймера, отожженного с немеченой экзоматрицей (таблица ). Подложки готовили, как описано выше. Реакции проводили путем добавления ДНК-полимеразы 9°N m (1 ед.) к 10 мкл раствора, содержащего 0.1 мкМ субстрата FAM-ДНК в буфере 1X ThermoPol. Образцы инкубировали при 72°С в течение 200 мин и гасили равным объемом 0,5 М ЭДТА. Превращение флуоресцентно меченной ДНК в более короткие продукты экзонуклеазы 3′-5′ контролировали с помощью КЭ, как описано выше.

Анализ активности ДНК-лигазы

ДНК-лигазы запечатывают поврежденную ДНК во время репликации и восстановления ДНК [рассмотрено в (20)]. Для мониторинга активности ДНК-лигазы субстрат ДНК-лигазы отжигали путем смешивания 5′-FAM-меченого акцепторного олигонуклеотида (50 нМ) (таблица), 5′-фосфорилированного немеченого донорного олигонуклеотида (таблица) (75 нМ) и одноцепочечного M13mp18. (75 нМ) (ssM13mp18) в 1X ThermoPol с добавлением 1 мМ АТФ, как описано выше.Добавляли 9°N ДНК-лигазу (10 нМ) и инкубировали 10 мин при 60°С. Реакции анализировали с помощью КЭ, как описано выше.

Анализ активности Fen1

Fen1 представляет собой специфичную для структуры лоскута эндонуклеазу, участвующую в репликации и репарации ДНК [рассмотрено в (21)]. Активность Fen1 измеряли путем анализа расщепления синтетического 3′-FAM-меченого ДНК-субстрата. ДНК-субстрат Fen1 готовили путем отжига меченого 3′-FAM олигонуклеотида (50 нМ), содержащего лоскут из 40 нуклеотидов, немеченого праймера Fen1 (75 нМ) (таблица) и ssM13mp18 (75 нМ) в буфере 1X ThermoPol, как описано выше.ДНК-субстрат лоскута Fen1 (5 нМ) смешивали с 9°N Fen1 (10 нМ) в 1X буфере ThermoPol и инкубировали в течение 10 мин при 60°С. Реакции анализировали с помощью КЭ, как описано выше.

Анализ активности РНКазы h3

Рибонуклеаза h3 (РНКаза h3) представляет собой эндорибонуклеазу, которая предпочтительно разрывает 5′-конец рибонуклеотида в дуплексе ДНК. РНКаза h3 участвует в репарации и репликации ДНК (22). Активность РНКазы h3 измеряли путем мониторинга расщепления гибридного олигонуклеотида РНК:ДНК (таблица).Олигонуклеотид РНКазы h3 (таблица) был сконструирован так, чтобы имитировать структуру расположенного ниже фрагмента Оказаки, имеющего 5′-РНК-праймер из 10 нуклеотидов, за которым следует ДНК из 49 нуклеотидов и меченный 3′-FAM. Субстрат РНКазы h3 отжигали путем смешивания олигонуклеотида 3′-FAM-РНКазы h3 (50 нМ) и кольцевой ДНК ssM13mp18 (75 нМ) в 1X буфере ThermoPol, как описано выше. Субстрат РНКазы h3 (5 нМ) инкубировали с РНКазой h3 (10 нМ) в 1X буфере ThermoPol в течение 10 мин при 60°C. Реакции с РНКазой h3 анализировали с помощью КЭ, как описано выше.

Анализ экзонуклеазной активности GAN

9°N GINS-ассоциированная нуклеаза (GAN) представляет собой 5′-3′-экзонуклеазу, специфичную для одноцепочечной ДНК (оцДНК) (23). Активность GAN на одноцепочечной или двухцепочечной ДНК с тупыми, 3′-утопленными концами или 3′-выступами отслеживали одновременно с использованием четырехцветного мультиплексного флуоресцентного анализа. Одноцепочечный ДНК-олигонуклеотид (оцДНК) метили внутренней FAM. Двухцепочечную ДНК получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Прямой праймер для ПЦР был флуоресцентно помечен на 5′-конце для обнаружения (либо NED, PET, либо VIC).Для создания двухцепочечной ДНК, имеющей 3′-липкий конец (5′-GCGC∧-3′), продукт ПЦР, меченный 5′-ПЭТ, расщепляли HaeII и очищали. 5′-VIC-меченый продукт ПЦР расщепляли BstYI с образованием 3′-утопленного конца (5′-∧GATC-3′). Для мониторинга 5′-3′-экзонуклеазной активности на различных субстратах NED-, PET-, VIC- и FAM-меченые субстраты (10 нМ) инкубировали с 9°N GAN (100 нМ) в 1X буфере ThermoPol в течение 15 мин при 65°С. °С. Реакции анализировали с помощью КЭ, как описано выше.

Анализ созревания флуоресцентных фрагментов Оказаки с двойной меткой

Во время репликации фрагменты Окадзаки процессируются в смежные отстающие нити под действием согласованного действия ДНК-полимеразы, перемещающей нити, лоскутной эндонуклеазы и ДНК-лигазы (24).Флуоресцентный анализ с двойной меткой был разработан для имитации условий созревания фрагмента Оказаки in vivo и одновременного наблюдения различных промежуточных продуктов реакции в одной пробирке. Этот анализ одновременно обнаруживает два флуоресцентных красителя и позволяет контролировать синтез ДНК-полимеразы из 5′-TAM-меченого удлиняющего праймера (таблица) и Fen1 плюс обработка ДНК-лигазы 3′-FAM-меченого фрагмента Окадзаки (таблица). Олигонуклеотид Окадзаки имитирует нижележащий фрагмент Окадзаки, который имеет 10 нуклеотидов РНК на 5′-конце, за которыми следуют 49 нуклеотидов ДНК и 3′-FAM-метка.Между удлинением и праймерами, блокирующими фрагмент Оказаки, имеется разрыв в 20 нуклеотидов в одноцепочечной ДНК. Субстрат для созревания фрагмента Оказаки готовили путем смешивания праймера для удлинения ТАМ (50 нМ), праймера, блокирующего FAM (75 нМ), и кольцевой ДНК ssM13mp18 (50 нМ) в 1X буфере ThermoPol, как описано выше. FAM-меченый праймер, блокирующий фрагмент Оказаки, находится в молярном избытке по сравнению с матрицей и праймером для удлинения, поэтому часть блокирующего праймера остается неотожженной и непрореагировавшей.

Типичные реакции созревания фрагмента Оказаки проводили путем смешивания субстрата для созревания фрагмента Оказаки (5 нМ), АТФ (1 мМ), dNTP (0.1 мМ), 9°N ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) (200 нМ), фактор репликации C (RFC) (400 нМ), polB (10 нМ), Fen1 (10 нМ) и ДНК-лигаза (10 нМ) в 1X Буфер ThermoPol. Реакции инкубировали при 60°С в течение 2 мин, останавливали ЭДТА (конечная концентрация 100 мМ) и анализировали методом КЭ, как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Здесь мы демонстрируем использование флуоресцентных олигонуклеотидных субстратов и высокопроизводительного КЭ для изучения ферментов, действующих на нуклеиновые кислоты. КЭ позволяет анализировать на порядок больше реакций по сравнению с традиционными анализами в ПААГ за аналогичный период времени.Как правило, CE позволяет анализировать 96 реакций за такое же или меньшее время, чем анализ 12 реакций на типичной гелевой системе PAGE. В дополнение к увеличению производительности флуоресцентные субстраты и продукты автоматически оцениваются программным обеспечением CE, что сокращает количество шагов, необходимых для получения результатов. Мы приводим примеры, которые иллюстрируют, как тесты могут быть адаптированы для высокопроизводительного КЭ-анализа ряда ферментов нуклеиновых кислот. В сопроводительной рукописи подробно описывается, как можно использовать высокопроизводительный анализ CE для систематической и всесторонней характеристики кинетики и точности ДНК-лигазы (25).

Чувствительность и воспроизводимость капиллярного гель-электрофореза

Для определения предела обнаружения CE различные концентрации меченого 3′-FAM олигонуклеотида разделяли и определяли CE, как описано выше. Линейный диапазон обнаружения составлял от 0,15 до 20 нМ (дополнительная фигура S1). Воспроизводимость оценивалась путем проведения восьми повторов анализа активности Fen1 при шести различных концентрациях Fen1 и анализа изменчивости (дополнительная фигура S2).Полученные продукты Fen1 имели погрешность в пределах 10% для всех повторов. Отклонения от предсказанных данных представляют собой смесь эффектов, включая неполный или переменный отжиг субстратов, трудности, присущие точному определению концентрации олигонуклеотидов, потенциальные зависящие от контекста вариации флуоресценции FAM и потенциальные различия при инъекциях CE. Таким образом, мы оцениваем 10%-ную ошибку в наших определениях площади пика.

Характеристика активности ДНК-полимеразы

ДНК-полимеразы реплицируют ДНК с исключительной точностью и эффективностью (26).Существенные исследования были посвящены пониманию структуры и функции ДНК-полимераз. Кинетические исследования ДНК-полимеразы описали путь реакции для правильного добавления нуклеотидов и механизмы для различения включения неправильных нуклеотидов [обзор в (27)]. В предыдущих исследованиях кинетики ДНК-полимеразы использовались 32 P-меченые праймеры/матрицы и электрофорез в электрофорезе для разделения и обнаружения продуктов синтеза полимеразы (28). В качестве альтернативы PAGE с высокой пропускной способностью мы адаптировали CE для наблюдения за удлинением флуоресцентно-меченых праймеров / матриц.Как обсуждается ниже, анализы CE могут быть разработаны для мониторинга кинетики однократного оборота (рис. ), синтеза замещения цепи (рис. ) и 3′-5′-экзонуклеазной активности (рис. ).

Характеристика активности ДНК-полимеразы. ( A ) Включение одного нуклеотида контролировали путем инкубации экзо- 9°N polD, 5′-FAM-праймера/матрицы и ТТР при 60°C с последующим гашением ЭДТА в различные моменты времени в течение 0–10 с. ( B , C ) Реакции разрешали с помощью 20% PAGE или электрофореза в капиллярном геле для сравнения миграции.( D ) Каждую временную точку капиллярного гель-электрофореза анализировали с использованием программного обеспечения Peak Scanner ( E ). Продукты реакции на панели D количественно определяли и наносили на график зависимость от времени ( k набл. = 1,8 с -1 ).

Синтез замещения цепи ДНК-полимеразы и 3′-5′-экзонуклеазная активность. ( A ) ДНК-полимераза T4 или ДНК-полимераза Bst, синтез замещения цепи больших фрагментов отслеживали путем удлинения 5′-FAM-меченого праймера/матрицы в присутствии блокирующего праймера на расстоянии 20 нуклеотидов от праймера удлинения.Продукты реакции анализировали методом капиллярного гель-электрофореза. (A III) Синтез ДНК-полимеразы Т4 останавливается при встрече с блокирующим олигонуклеотидом, расположенным ниже по течению, что дает продукт удлинения 44 нуклеотида. (A IV) ДНК-полимераза Bst, цепь большого фрагмента замещает блокирующий олигонуклеотид, чтобы полностью скопировать матричную цепь из 71 нуклеотида. ( B ) 3′-5′ экзонуклеазную активность (обозначенную треугольниками) контролировали путем инкубации ДНК-полимеразы при 9°Nm и меченного 5′-FAM праймера/матрицы. (B III) 9°Nm ДНК-полимераза 3′-5′-экзонуклеазная активность разрушает 50-нуклеотидный 5′-FAM-меченый праймер, что приводит к более коротким продуктам (<50 нт).

На рисунке показано использование КЭ для анализа кинетики однократной ДНК-полимеразной реакции, как описано в разделе «Материалы и методы». Поскольку большинство одиночных оборотов для правильных нуклеотидов являются быстрыми (от 10 с -1 до 100 с -1 ), для сбора быстрых временных точек (> 2,0 мс) требуется прибор для быстрого химического гашения (RQF) (29). ). В этом примере включение dTTP (100 мкМ) экзо- polD измеряли с использованием RQF для анализа реакций между 0 и 10 с.Субстрат из 50 нуклеотидов и продукт удлинения dTTP из 51 нуклеотида разделяли с помощью PAGE или CE для сравнения (рис. ). Концентрацию продукта определяли количественно и наносили на график зависимости от времени, чтобы получить скорость включения dTTP ( k obs = 1,8 с -1 ) (рис. 1). Коэффициент включения ( тыс. набл. ) соответствовал значениям, опубликованным в литературе (30).

Для изучения синтеза замещения цепи ДНК-полимеразой отслеживали удлинение 5′-FAM-праймера в присутствии нижестоящего блокирующего олигонуклеотида (рис. ).Во время полимеризации присутствие нижестоящей цепи может блокировать дальнейшую полимеризацию или может быть вытеснено синтезом замещения цепи ДНК-полимеразой. ДНК-полимераза ϕ29 сочетает эффективный синтез ДНК со смещением цепи для синтеза очень длинных молекул ДНК (31). ДНК-полимеразы Т4 и Т7 лишены активности замещения цепи и останавливают синтез при встрече с расположенной ниже цепью (32). Предыдущие исследования использовали PAGE для мониторинга синтеза смещения нити на субстрате с зазором (32-34).Вместо этого мы адаптировали анализ смещения нити, чтобы сделать возможным анализ с помощью КЭ с использованием флуоресцентно меченных праймеров для удлинения. Как и ожидалось, ДНК-полимераза Т4 не обладает активностью замещения цепи и останавливается при столкновении с нижестоящим блокирующим олигонуклеотидом, оставляя продукт длиной 44 нуклеотида (рис. 1). Напротив, ДНК-полимераза больших фрагментов Bst имеет устойчивый синтез замещения цепи, который замещает нижележащий блокирующий олигонуклеотид, полностью копируя матричную цепь (71 нт) (рис. 1). Анализ замещения цепи CE представляет собой простой качественный анализ, позволяющий определить, поддерживает ли ДНК-полимераза синтез замещения цепи.Однако размер ДНК, обнаруженный с помощью CE, ограничен, поэтому события смещения длинных цепей (> 800 нт) выходят за пределы обнаружения CE, поэтому следует использовать другие методы анализа, такие как PAGE.

Некоторые ДНК-полимеразы также обладают корректирующей активностью. Если встраивается неверный нуклеотид, 3′-5′-экзонуклеазная активность полимеразы удаляет неправильный нуклеотид, давая полимеразе еще одну возможность включить правильный нуклеотид (35). В отсутствие dNTP активность 3′-5′-экзонуклеазы ДНК-полимеразы удаляет dNMP с 3′-конца независимо от наличия правильного основания или несовпадения оснований.3′-5′-экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы 9°N m изучали с использованием 5′-FAM-меченого праймера/матрицы без dNTP. Мы наблюдали расщепление экзонуклеазой и, следовательно, укорочение праймера 5′-FAM (рис. 1). CE четко разрешает образование многих продуктов расщепления экзонуклеазой, каждый из которых может быть определен количественно. Характер 3′-5′-экзонуклеазной деградации 5′-FAM-праймера в этом исследовании согласуется с предыдущими данными о 9°N m 3′-5′-экзонуклеазной деградации 5′- 32 P праймера, разрешенного по СТРАНИЦЕ (36).

Характеристика активности ДНК-лигазы, Fen1 и РНКазы h3

ДНК-лигаза, Fen1 и РНКаза h3 играют ключевые роли во время репликации ДНК, репарации и метаболизма РНК (24). ДНК-лигаза запечатывает разрывы ДНК, образовавшиеся во время репарации ДНК и созревания фрагментов Окадзаки (37). Мы наблюдаем лигирование ДНК с помощью CE путем соединения флуоресцентного олигонуклеотидного донора (24 нуклеотида) и 30-нуклеотидного немеченого олигонуклеотидного акцептора, создавая продукт лигирования размером 54 нуклеотида (рис. ). Прилагаемая рукопись представляет собой подробный пример использования метода КЭ для всесторонней характеристики кинетики и точности ДНК-лигазы.Fen1 отвечает за удаление 5′-лоскутов, образующихся во время репарации и репликации ДНК. Используя анализ CE, мы наблюдаем отщепление непарного 5′-лоскута Fen1 от 3′-FAM-меченого субстрата лоскута, что приводит к продукту размером 40 нт (рис. ). Анализ CE активности Fen1 обеспечивает более подробную информацию о сайтах расщепления Fen1 и промежуточных продуктах по сравнению с методами конечной точки FRET или FP, использовавшимися ранее (9,10), что ускоряет характеристику фермента. Наконец, мы наблюдаем активность РНКазы h3 по потере части РНК из 10 нуклеотидов олигонуклеотидного праймера/матрицы 3′-FAM-РНК/ДНК, что приводит к продукту из 49 нуклеотидов (рис. ).Важно отметить, что КЭ можно использовать для анализа субстратов и продуктов как РНК, так и ДНК.

Характеристика ферментов репликации и репарации ДНК с помощью капиллярного гель-электрофореза. Ферменты репликации ДНК-лигазу, эндонуклеазу Fen1 и РНКазу h3 анализировали на активность, как описано в разделе «Материалы и методы». Все продукты реакции разделяли и анализировали методом капиллярного гель-электрофореза. ( A ) Субстрат для лигирования ДНК готовили путем отжига 5′-FAM-праймера (синий), немеченого олигонуклеотида с 5′-фосфатом (черный) и матрицы ssM13mp18.(A III) ДНК-лигаза 9°N запечатывает 5′-FAM-праймер и немеченый олигонуклеотид с получением продукта длиной 54 нуклеотида. ( B ) Субстрат Fen1 получали путем отжига олигонуклеотида 3′-FAM (синий), имеющего непарный лоскут из 40 нуклеотидов, немеченого олигонуклеотида (черный) и матрицы ssM13mp18. (B III) Fen1 расщепляет лоскутные структуры, образуя продукт размером 40 нуклеотидов. ( C ) Олигонуклеотид из 59 нуклеотидов, имеющий 10 нуклеотидов РНК на 5′-конце (зеленый) и 3′-FAM-метку, отжигали с матрицей ssM13mp18. (C III) 9°N РНКаза h3 расщепляет РНК-часть субстрата длиной 10 нуклеотидов, оставляя 49-нуклеотидный продукт, меченный 3′-FAM.

Характеристика 5′-3′-экзонуклеазной активности одноцепочечной ДНК GAN с помощью четырехцветного флуоресцентного анализа и капиллярного гель-электрофореза. ( A ) Для определения субстратной специфичности экзонуклеазы GAN были приготовлены четыре субстрата с флуоресцентной меткой, как описано в разделе «Материалы и методы». (AI) оцДНК была помечена внутри FAM (50 нуклеотидов, синий). (A II) ДцДНК с тупыми концами с меткой 5′-NED (154 нуклеотида; черный). (A III) дцДНК, имеющая 3′-удлинение с 5′-меткой ПЭТ (166 нуклеотидов; красный). (A IV) дцДНК с 3′-утопленным концом и 5′-VIC-меткой.( B ) Четыре субстрата разделяются с помощью капиллярного гель-электрофореза в виде отдельных пиков, имеющих разные спектры флуоресценции. (B) В соответствии с ранее описанной активностью (23), 5′-3′-экзонуклеаза 9°N GAN активна на субстратах одноцепочечной ДНК, о чем свидетельствуют продукты 5′-3′-экзонуклеазы одноцепочечной ДНК, меченные FAM.

Характеристика субстратной специфичности экзонуклеазы 9°N GAN с использованием четырехцветного флуоресцентного анализа

Нуклеаза GAN представляет собой процессивную одноцепочечную ДНК-специфическую экзонуклеазу, которая расщепляет ДНК в 5′-3′ направлении.GAN связывается с GINS и ДНК-полимеразой семейства D как часть реплисомы, хотя ее роль во время репликации не совсем понятна (23). Чтобы охарактеризовать специфичность и активность субстрата GAN, мы разработали мультиплексный четырехцветный флуоресцентный анализ с панелью субстратов ssDNA и dsDNA. Объединив четыре субстрата в одну реакционную пробирку, можно одновременно анализировать ферментативную активность на всех субстратах с помощью КЭ. GAN разрушает только одноцепочечную ДНК, что обнаруживается путем разложения одноцепочечной ДНК, меченной FAM.GAN не имеет заметной активности в отношении тупой, 3′-утопленной или 3′-удлиненной двухцепочечной ДНК (рис. 1). Благодаря одновременному обнаружению четырех различных флуоресцентных меток с помощью КЭ можно четко идентифицировать субстраты и полученные продукты. Наблюдаемая здесь специфичность расщепления GAN требует для анализа одного капилляра CE и согласуется с предыдущим исследованием, в котором использовалось несколько дорожек полиакриламидного геля (23).

Характеристика созревания фрагмента Окадзаки с использованием двухметочного флуоресцентного анализа

Во время синтеза отстающей цепи короткие фрагменты Оказаки синтезируются прерывисто и перерабатываются в непрерывную отстающую цепь.Процесс соединения фрагментов Окадзаки включает удаление рибонуклеотидов на 5′-конце каждого фрагмента Оказаки, заполнение пробелов и лигирование полученных разрывов ДНК. Здесь мы разработали двухцветный флуоресцентный анализ для мониторинга созревания фрагментов Окадзаки (обрисовано в общих чертах на рисунке). Во время этого процесса polB удлиняет 5′-TAM-меченый удлиняющий праймер, а синтез замещения цепи создает лоскутные структуры в 3′-FAM-меченном фрагменте Окадзаки. Fen1 расщепляет лоскутные структуры, образуя надрез. Продукты Fen1 визуализируются как более короткие продукты, меченные 3′-FAM (рис. 1).Наконец, ДНК-лигаза соединяет вместе 5′-TAM-праймер и 3′-FAM-меченые олигонуклеотиды с получением процессированного фрагмента Окадзаки длиной 103 нуклеотида (рис. 1). Благодаря дизайну анализа с двойной маркировкой можно количественно оценить субстраты, промежуточные продукты и продукты реакции, меченные 5′-TAM и 3′-FAM, что позволяет детально понять кинетику пути созревания фрагмента Окадзаки.

Характеристика созревания фрагментов Оказаки и обнаружение промежуточных продуктов реакции с помощью капиллярного гель-электрофореза.( A ) Упрощенная схема созревания фрагмента Окадзаки и ожидаемые результаты капиллярного гель-электрофореза. (I) Вместе с PCNA/RFC ДНК-полимераза инициирует синтез праймера 5′-TAM-удлинения длиной 24 нуклеотида, что приводит к продуктам длиной более 24 нуклеотидов. (II) Смещение цепи ДНК-полимеразы нижележащего фрагмента Оказаки (блокирующий праймер) создает лоскутные структуры, которые (III) расщепляются Fen1, что приводит к удалению части РНК. (IV) Оставшийся разрыв ДНК:ДНК затем запечатывают с помощью ДНК-лигазы, чтобы получить процессированный фрагмент Оказаки, меченный двойным 5′-TAM- и 3′-FAM (103 нуклеотида).( B ) 9°N polB, Fen1, ДНК-лигазу, PCNA и RFC инкубировали с субстратом для созревания фрагментов Оказаки при 60°C, как описано в разделе «Материалы и методы». Реакционные аликвоты отбирали через 0 и 2 мин, гасили ЭДТА и анализировали с помощью капиллярного гель-электрофореза.

ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ флуоресцентных субстратов с помощью капиллярного гель-электрофореза предлагает высокопроизводительный и высокочувствительный метод исследования ферментативной активности, ведущий к более полному пониманию метаболизма нуклеиновых кислот.Каждый из представленных здесь примеров демонстрирует полезность КЭ для углубленного анализа различных ферментов, действующих на нуклеиновые кислоты. Использование КЭ в качестве аналитического инструмента коренным образом меняет масштаб и сложность экспериментального дизайна. Вместо того, чтобы проводить несколько реакций с одним субстратом, можно одновременно контролировать множество субстратов в одной и той же пробирке, меняя размер субстрата и флуоресцентные метки. Кроме того, 96 реакций могут быть легко обработаны и проанализированы параллельно, что позволяет получить более полное представление об активности ферментов.

Анализы КЭ также можно адаптировать для изучения практически любого фермента, действующего на флуоресцентные олигонуклеотиды ДНК или РНК. В дополнение к анализам, описанным здесь, флуоресцентные олигонуклеотиды могут быть разработаны для изучения восстановления ДНК, рекомбинации, ограничения и модификации и метаболизма РНК. Флуоресцентные субстраты, содержащие повреждения или несоответствия ДНК или РНК, могут быть использованы для исследования активности репарации ДНК известных ферментов репарации и репликации ДНК, таких как ДНК-гликозилазы, включая UDG, Fpg, AAG, OGG1 и SMUG1, или эндонуклеаз III, IV, V, VIII и ОБЕЗ1.Та же панель субстратов также может быть использована для скрининга клеточных экстрактов на активность новых ферментов репарации при репарации эксцизией оснований, репарации несоответствия ДНК или репарации эксцизией нуклеотидов. Точно так же механизмы гомологичной рекомбинации и негомологичного соединения концов могут быть изучены путем наблюдения за рекомбинацией меченых субстратов. Специфичность сайтов рестрикционных эндонуклеаз и параметры реакции можно определить с использованием панели флуоресцентно меченных субстратов, содержащих вариабельные последовательности распознавания.Анализ с помощью КЭ не ограничивается ДНК, а также является отличным методом изучения ферментов метаболизма РНК. Например, можно отслеживать расширение обратной транскриптазой флуоресцентных праймеров на матрицах РНК, а также деградацию РНК с помощью РНКазы H. рак, аутоиммунные состояния и вирусная или бактериальная инфекция (38). Например, клинически значимые лекарственные мишени, такие как ДНК-полимеразы вируса простого герпеса (ВПГ), могут быть проверены на ингибирование ингибиторами нуклеотидов с использованием тех же принципов дизайна анализа, которые описаны здесь.

Как сделать буфер TBE за 3 простых шага

Буфер TBE (трис-борат-ЭДТА) представляет собой буферный раствор, состоящий из трис-основания, борной кислоты и ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты). Этот буфер часто используется для электрофореза в агарозном геле при анализе продуктов ДНК, полученных в результате амплификации ПЦР, протоколов очистки ДНК или экспериментов по клонированию ДНК.

TBE использует

Буфер TBE особенно полезен для разделения небольших фрагментов ДНК (молекулярная масса < 1000), таких как небольшие продукты расщепления рестрикционными ферментами.TBE обладает большей буферной емкостью и дает более четкое разрешение, чем буфер TAE. Буфер TAE (трис-ацетат-ЭДТА) представляет собой раствор, состоящий из трис-основания, уксусной кислоты и ЭДТА.

TBE, как правило, дороже, чем TAE, и ингибирует ДНК-лигазу, что может вызвать проблемы, если предполагается последующая очистка ДНК и этапы лигирования. Выполнив следующие три простых шага, вы узнаете, как создать буфер TBE. Создание не должно занимать более 30 минут.

Что вам нужно

Чтобы сделать буфер TBE, вам понадобится всего четыре вещества.Остальные предметы в этом списке — это оборудование. Требуемые четыре вещества: динатриевая соль ЭДТА, трис-основание, борная кислота и деионизированная вода.

Что касается оборудования, вам понадобится рН-метр и стандарты калибровки, если это необходимо. Кроме того, вам понадобятся мензурки или фляги на 600 и 1500 миллилитров. Дополняют ваше оборудование градуированные цилиндры, мешалки и мешалки.

Прежде чем начать, проверьте инвентарь в лаборатории, которую вы будете использовать, чтобы убедиться, что у вас есть все необходимое.Нет ничего хуже, чем остановиться посреди приготовления раствора, потому что у вас закончились нужные материалы.

Если ваша лаборатория находится в школе или на вашем рабочем месте, уточните у соответствующего персонала, есть ли у них все предметы на складе. В конечном итоге это может сэкономить вам время и энергию.

Масса формулы обозначается аббревиатурой FW. Это атомный вес элемента, умноженный на количество атомов каждого элемента в формуле, а затем сложенный вместе все массы каждого элемента.

Исходный раствор ЭДТА

Раствор ЭДТА следует приготовить заранее. ЭДТА не перейдет полностью в раствор, пока рН не будет доведен до примерно 8,0. Для исходного раствора 0,5 М ЭДТА объемом 500 мл взвесьте 93,05 г динатриевой соли ЭДТА (FW = 372,2). Затем растворите его в 400 миллилитрах деионизированной воды и отрегулируйте pH с помощью NaOH (гидроксида натрия). После этого долейте раствор до конечного объема 500 миллилитров.

Стандартный раствор TBE

Приготовьте концентрированный (5x) исходный раствор TBE, взвесив 54 грамма трис-основания (FW = 121.14) и 27,5 граммов борной кислоты (FW = 61,83) и растворения обоих примерно в 900 миллилитрах деионизированной воды. Затем добавьте 20 миллилитров 0,5 М (молярность или концентрация) ЭДТА (pH 8,0) и доведите раствор до конечного объема 1 литр. Этот раствор можно хранить при комнатной температуре, но в более старых растворах будет образовываться осадок. Храните буфер в стеклянных бутылях и выбросьте, если образовался осадок.

Рабочий раствор TBE

Для электрофореза в агарозном геле можно использовать буфер TBE в концентрации 0.5x (1:10 разбавление концентрированного бульона). Разбавьте исходный раствор в 10 раз деионизированной водой. Конечные концентрации растворенных веществ составляют 45 мМ трис-бората и 1 мМ (миллимолярная) ЭДТА. Теперь буфер готов к использованию в работе с агарозным гелем.

Капиллярный электрофорез с глицерином в качестве добавки

Для разделения ДНК с помощью высокоэффективного капиллярного электрофореза (КЭ) часто используются два вида полужидких разделительных сред, а именно динамическая или запутанная полимерная просеивающая матрица в свободном растворе и разбавленные жидко-гелевые растворы.Полимер

 …подробнее

Для разделения ДНК с помощью высокоэффективного капиллярного электрофореза (КЭ) часто используются два вида полужидких разделительных сред, а именно динамическая или запутанная полимерная просеивающая матрица в свободном растворе и разбавленные жидко-гелевые растворы. Растворы полимеров можно определить в трех различных функциональных концентрациях: разбавленные, полуразбавленные и смешанные. В разбавленных растворах молекулы полимера физически разделены; по мере увеличения концентрации полимера молекулы начинают взаимодействовать, а при критической концентрации полимеры начинают физически взаимодействовать, образуя запутанную физическую сеть (1–3).Эти среды обладают способностью действовать как селективные по размеру просеивающие агенты, которые разделяют молекулы ДНК, но, поскольку среды являются жидкими, введение свежей среды и удаление израсходованной среды облегчается. Среды обычно представляют собой нейтральные полимеры с высокой молекулярной массой и полимерные сахара, которые обеспечивают высокую однородность среды для электрофореза, если подавляются эффекты капиллярного электроосмотического потока (EOF). Для целей данного обзора особое внимание будет уделено капиллярному электрофорезу в свободном растворе (ESCE) с использованием трис-борат-ЭДТА (TBE) буферов с глицерином в качестве добавки.Для разделения ДНК использовались многие различные просеивающие среды ESCE и разбавленные жидко-гелевые растворы (таблица 1): полисахаридные полимеры, такие как гидроксипропилцеллюлоза (ГПЦ) (2–4), гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПМЦ) (5–7) , метилцеллюлоза (8,9), гидроксиэтилцеллюлоза (ГЭЦ) (3,7,10–15), декстран (16,17), TreviSol (18), полужидкая агароза (19,20) и галактоманнаны (1 ). Несахаридные полимеры, такие как линейные полиакриламиды и замещенные полиакриламиды (3, 7, 10–26), линейные и разветвленные поли(этиленоксиды) и поливиниловые полимеры (27), также используются для самых разных целей разделения.Таблица 1. Применение буферов, содержащих глицерин, для анализа ДНК с помощью матричного буферного детектора CE a Комментарий Ref. dsDNA PCR-RFLP HPMC TBE/глицерин ± этидий УФ, LIF Глицерин улучшает разрешение 5,6,46,47,49 dsDNA PCR-RFLP 0.2–1% ГЭЦ КЭ УФ Хорошее разрешение 2,4,10,11 STR-PCR PCR-RFLP 0,5% MC 0,5–2,5X TBE TAE YoPro, LIF, без красителя, УФ Лучшее разрешение в TBE 8,9,15 STR- ПЦР ПЦР-ПДРФ 1.25% ГЭК ТВЕ 7 Муреа без красителя, УФ Хорошее разрешение нескольких плазмид STR 14 Supercoil 0,1–0,3% ГЭК 0,5–2,5X ТВЕ УФ Хорошее разрешение 54 дцДНК LCR HPMC TBE/глицерин LIF Хорошее разрешение 25 и 50 п.н. 48 дцДНК ПЦР-ПДРФ 0.5% ПЭО КЭ/красители LIF Хорошее разрешение 27,55 дцДНК ПЦР-ПДРФ Жидкий КЭ Лучшее разрешение при КЭ 20,39 Арагоза TAE дцДНК ПЦР-ПДРФ Тревизол TAPS УФ Хорошее разрешение 18 HPA ГПМЦ ТВЕ/глицерин±этидий УФ, LIF Глицерин улучшает разрешение 50 с SCP HPMC TBE/глицерин ± этидий УФ.LIF Глицерин стабилизирует конфомеры 51 SSCP LPA TBE±глицерин UV Хорошее разрешение 17,22,52,57 dsDNA PCR-RFLP LPA TBE±ethidium UV Хорошее разрешение 21,24,44 RNA HPMC TBE 7 Murea UV Глицерин снижает разрешение 45 a Некоторые комментирует действие глицерина d бората на разрешении ДНК.

меньше

Гель-электрофорез для идентификации лигазы с существенным…

Контекст 1

… селективность лигаз для различения m 6 A от A является ключевым вопросом для лигазо-зависимой ПЦР для обнаружения m 6 А в РНК. Таким образом, мы, во-первых, выявляем существенную селективность лигаз против m 6 A. В качестве матриц используют пару 69-членных синтетических сегментов днРНК MALAT1, соответственно содержащих m 6 A или A в 2577-м сайте.Зонд L1 и зонд R1 D, который аналогичен зонду R1, но без модификации на его 3′-конце двумя рибонуклеотидами, сначала используют для гибридизации с сегментами РНК2577-A или РНК2577-m 6 A, а затем лигируют. с катализом различных лигаз. Лигированные продукты амплифицируют с помощью ПЦР, а продукты ПЦР определяют с помощью гель-электрофореза. Как показано на рисунке 2(а), когда интенсивность пикселей продуктов ПЦР, полученных из сегмента РНК2577-А, определена как 100, отношение интенсивности пикселей, полученных из сегмента РНК2577-m6A, к интенсивности пикселей, полученных из сегмента РНК2577-А, с использованием разных лигаз составляет 24.5:100 (ДНК-лигаза Т3), 32,1:100 (РНК-лигаза Т4 2), 79,1:100 (ДНК-лигаза Т4), 64,4:100 (ДНК-лигаза Т7) и 77,7:100 (ДНК-лигаза Taq) соответственно, в которых ДНК Т3 Пожалуйста, не меняйте…

Контекст 2

… не меняйте маргинальные лигазы и РНК-лигазы Т4 2 показывают хорошую селективность для распознавания m 6 A из A в РНК. Сообщалось, что при использовании молекулы РНК в качестве матрицы для лигирования ДНК-зондов модификация двумя рибонуклеотидами одного ДНК-зонда на его 3′-конце может значительно улучшить специфичность и эффективность лигазной реакции.23 Поэтому зонд L1 и зонд R1 с модификацией двух рибонуклеотидов на его 3′-конце используются для дальнейшего исследования селективности ДНК-лигазы Т3 и РНК-лигазы Т4 2. Как показано на рис. 2(b), с помощью зонда L1 и R1 отношение интенсивности пикселей, полученных из сегмента РНК2577-m 6 A, к интенсивности пикселей, полученных из сегмента RNA2577-A, достигает 6,87:100 (ДНК-лигаза Т3) и 30,5:100 (РНК-лигаза Т42) соответственно. Эти результаты показывают, что ДНК-лигаза Т3 обладает наибольшей селективностью для различения m 6 A от A в РНК, и модификация зонда R1 двумя рибонуклеотидами может значительно улучшить селективность.Модификация m 6 A представляет собой однократное метилирование аденозина в положении N 6 . Метильная группа мала и химически инертна. Что еще более важно, метилированное положение N 6 сохраняет свою способность отдавать водородную связь, так что m 6 A все еще может образовывать пары оснований Уотсона-Крика. 17 Следовательно, чрезвычайно трудно специфически распознать m 6 A от A в РНК. 18 К счастью, как показано выше, мы обнаружили, что разные лигазы обладают разной идентифицирующей способностью в отношении m 6 A, а ДНК-лигаза T3 проявляет наибольшую селективность, что следует приписать их способности распознавать между m 6 A:T и A:T.Мы также продемонстрировали, что ДНК-лигаза Т3 проявляет лучшую селективность для различения m 6 A:U и A:U, когда зонд R1 модифицирован двумя рибонуклеотидами на его 3′-конце. Определены температуры плавления (Tm) гибридов сегментов РНК и зондов, которые составляют 44,3 °С (РНК2577-A/зонд L1 -зонд R1D), 43,8 °С (РНК2577-m 6 A/зонд L1 — зонд R1D), 43,7 ° C (РНК2577-A / зонд L1 — зонд R1) и 41,4 ° C (РНК2577-m 6 A / зонд L1 — зонд R1) соответственно (см. Рисунок S1). Соответственно модификация m 6 A снижает значение Tm только на 0.5 °С в присутствии пар m 6 А:Т и А:Т. А в присутствии пар m 6 A:U и A:U значение Tm может быть снижено на 2,3 °C, что также делает ДНК-лигазу Т3 более селективной для распознавания m 6 A и A в РНК. Оценка влияния основных последовательностей на специфичность В 2012 г. Dan Dominissini et al. обнаружили, что все последовательности с m 6 A соответствуют вырожденному консенсусу RRACH (A=m 6 A, R=A или G, H=U или A), 15 и наиболее распространенными коровыми последовательностями для m 6 A являются GGACU, AAACU, AGACU. и ГГАКА. Основная последовательность РНК 2577 представляет собой GGACU.Чтобы оценить влияние основных последовательностей на специфичность предлагаемого лигазозависимого ПЦР, основные последовательности РНК 2577 (GGACU) заменены на AAACU, AGACU и GGACA соответственно. Соответствующие РНК, содержащие A или m 6 A, определяются соответственно как РНК AAACU-A или РНК AAACU-m 6 A, РНК AGACU-A или РНК AGACU-m 6 A, РНК GGACA-A или РНК GGACA-m 6 A. Эти РНК используются для проведения экспериментов по специфичности. Эксперименты проводят с использованием тех же процедур с использованием ДНК-лигазы Т3, как показано выше.Результаты показаны на рис. 3, отношение интенсивности пикселей, полученных из сегмента m 6 A, к интенсивности пикселей, полученных из сегмента A, достигает 7,20:100 (РНК AAACU), 7,70:100 (РНК AGACU) и 5,46:100 (РНК GGACA) соответственно. Эти результаты показывают, что основные последовательности мало влияют на специфичность предлагаемого лигазозависимого ПЦР-анализа. …

Контекст 3

… предложенный лигазозависимый анализ ПЦР, мы систематически исследуем влияние экспериментальных параметров, включая температуру лигирования, время лигирования и количество ДНК-лигазы Т3, на селективность и чувствительность для обнаружения m 6 A и оптимизации экспериментальных условий (см. рис. S2~S4).В оптимальных экспериментальных условиях аналитическая эффективность лигазозависимого ПЦР оценивается с использованием измерений флуоресцентной ПЦР в реальном времени, в которых Supper Green I используется в качестве флуоресцентного красителя для обнаружения продуктов ПЦР в реальном времени. Как показано на рисунке 4(а), могут быть получены четкие кривые флуоресценции в реальном времени, которые продуцируются сегментом РНК2577-А в диапазоне концентраций от 4 фМ до 4 нМ. Когда значения CT (количество циклов флуоресцентного сигнала каждой реакции до порогового значения) нанесены на график в зависимости от логарифма (lg) концентрации РНК2577-A, как показано на рисунке 4(b), превосходная линейная зависимость полученный.Уравнение линейной регрессии представляет собой CT = -8,59 -3,14 lgCRNA2577-A (M) с соответствующим коэффициентом корреляции R 2 0,998. В то же время, как показано на рис. 4(с), значения CT, продуцируемые RNA2577-m 6 A при тех же концентрациях, намного меньше значений, продуцируемых RNA2577-A. В соответствии с калибровочной кривой, показанной на рисунке 4(b), значения CT, полученные с помощью 4 пМ RNA2577-m 6 A, соответствуют концентрации RNA2577-A 73,9 фМ. Таким образом, селективность лигазозависимой ПЦР для обнаружения m 6 A в РНК составляет 54.1-кратный. Особо следует отметить, что сигнал флуоресценции в реальном времени, создаваемый 400 фМ РНК2577-m 6 A, почти такой же, как и у контрольного образца. То есть, когда общая концентрация РНК-мишени, подлежащая обнаружению, меньше, чем затем. Затем мы проверяем, можно ли использовать лигазо-зависимый анализ ПЦР для количественного обнаружения m 6 A-содержащей РНК. Сегмент РНК2577-A и сегмент РНК2577-m 6 A сначала смешивают с общей концентрацией 400 фМ в качестве синтетических образцов, в которых пропорции РНК 2577-m 6 A составляют 0%, 10%, 30%, 50%, 80%, 100% соответственно.Затем концентрацию РНК2577-А определяют с помощью лигазозависимой ПЦР в соответствии с калибровочной кривой, показанной на рисунке 4(b). Концентрация РНК2577-m 6 A равна 400 фМ минус концентрация РНК2577-A. Как показано в Таблице S2, обнаруженные концентрации РНК2577-m 6 A хорошо согласуются с добавленными концентрациями, что указывает на то, что предлагаемый анализ можно использовать для количественной оценки степени содержания РНК-содержащего m 6 A в образцах РНК при определенных условиях. сайта, когда общая концентрация РНК меньше 400 мкМ…

%PDF-1.4 % 180 0 объект > эндообъект внешняя ссылка 180 78 0000000016 00000 н 0000002705 00000 н 0000002929 00000 н 0000002964 00000 н 0000003227 00000 н 0000003332 00000 н 0000003437 00000 н 0000003542 00000 н 0000003647 00000 н 0000003752 00000 н 0000003856 00000 н 0000003961 00000 н 0000004066 00000 н 0000004396 00000 н 0000005184 00000 н 0000005221 00000 н 0000010172 00000 н 0000010748 00000 н 0000011134 00000 н 0000011592 00000 н 0000011670 00000 н 0000012406 00000 н 0000013076 00000 н 0000013625 00000 н 0000014182 00000 н 0000014732 00000 н 0000015273 00000 н 0000015570 00000 н 0000016184 00000 н 0000016440 00000 н 0000016704 00000 н 0000016963 00000 н 0000017235 00000 н 0000017516 00000 н 0000017794 00000 н 0000018068 00000 н 0000018344 00000 н 0000018622 00000 н 0000018897 00000 н 0000019168 00000 н 0000019442 00000 н 0000019697 00000 н 0000019956 00000 н 0000020222 00000 н 0000021124 00000 н 0000023818 00000 н 0000024607 00000 н 0000024845 00000 н 0000025168 00000 н 0000025247 00000 н 0000025304 00000 н 0000025442 00000 н 0000025563 00000 н 0000025692 00000 н 0000025783 00000 н 0000025869 00000 н 0000026026 00000 н 0000026110 00000 н 0000026192 00000 н 0000026380 00000 н 0000026464 00000 н 0000026546 00000 н 0000026690 00000 н 0000026774 00000 н 0000026856 00000 н 0000027000 00000 н 0000027084 00000 н 0000027166 00000 н 0000027328 00000 н 0000027412 00000 н 0000027494 00000 н 0000027652 00000 н 0000027757 00000 н 0000027849 00000 н 0000027967 00000 н 0000028085 00000 н 0000002537 00000 н 0000001894 00000 н трейлер ]>> startxref 0 %%EOF 257 0 объект >поток xb«`f`x𙁟X,b,`_kO]U(vVŌ/7e%b$8zevK.0`

Дифференциальная субстратная специфичность PROTAC, определяемая ориентацией привлеченной лигазы E3

Культура клеток

Клетки MDA-MB-231 и HeLa были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC), культивированы в среде RPMI-1640 (1 × ) и среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM; 1 × ), соответственно, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицин и выращенную во влажном инкубаторе при 37 °C и 5% CO 2 . Для расширенных экспериментов по зависимости доза-реакция клеток MDA-MB-231 (дополнительная фигура 3) во всю инкубационную среду добавляли 0.025% Tween 80 и ДМСО 68 для повышения растворимости PROTAC при более высоких концентрациях.

Иммуноблоттинг

Лизаты клеток MDA-MB-231 однократно промывали ледяным PBS (1 × ) с последующим лизисом в буфере, содержащем 25 мМ Трис [pH 7,5], 0,25% дезоксихолата натрия, 1% Triton X- 100, дополненный коктейлем ингибиторов протеазы 1X (Roche) и ингибиторами фосфатазы (10 мМ NaF, 1 мМ Na 3 VO 4 и 20 мМ β-глицерофосфата), если не указано иное.Лизаты центрифугировали при 14 000 ×  г в течение 10 минут при 4 °C, а супернатант оценивали на содержание белка с использованием анализа белка Pierce BCA (ThermoFisher Scientific). Во всех экспериментах 25–50 мкг белка наносили на 10% гели SDS-PAGE или 4–20% сборные градиентные гели Criterion TGX (Bio-Rad), переносили на нитроцеллюлозные мембраны и зондировали указанными антителами в течение ночи при 4 °С. C в 1X TBS-Tween (трис-буферный физиологический раствор плюс 0,02% Tween 20), содержащем 5% обезжиренного молока. Иммуноблоты визуализировали с помощью прибора для визуализации Bio-Rad ChemiDoc, а затем обрабатывали и количественно определяли с помощью прилагаемого программного обеспечения Bio-Rad ImageLab.См. Дополнительный рисунок 8 для необрезанных сканов вестерн-блотов, показанных на рисунках основного текста.

Кроличьи антитела, приобретенные у Cell Signaling Technologies (CST), с соответствующими разведениями антител: p38α (#9218) 1:2000, p38δ (#2308) 1:1000, p38β (#2339) 1:1000, p38γ ( #2307) 1:500, ERK2 (#9108) 1:2000, JNK2 (#9258) 1:1000 и VHL (#68547) 1:5000. Дополнительные антитела, приобретенные в CST с соответствующими разведениями, следующие: мышиный HA-tag (#2367) 1:1000, мышиный JNK1 (#3708) 1:1000 и конъюгат FLAG (DYKDDDDK) Tag Sepharose bead (#70569).Мышиные антитела, приобретенные у Sigma-Aldrich, с соответствующими разведениями антител, являются следующими: альфа-тубулин (#T9026) 1:5000 и FLAG M2 (#F1804) 1:1000. Rabbit Cullin 2 (CUL2) был приобретен у ThermoFisher Scientific (#700179) 1:5000, а ERK1 кролика (C-16) 1:2000 у Santa Cruz Biotechnology (#sc-93).

Конструкции, экспрессия белка и очистка

Человеческая p38alpha-MAPK (MAPK14) дикого типа была получена в дар от доктора Д. Мартина Уоттерсона (Северо-Западный университет, при MTA) и была описана ранее 69 .Плазмида содержит N-концевую метку His 6 и кодирует область, охватывающую аминокислоты 2–360 киназы p38α человека (эталонная последовательность NCBI: NM_139012). Клетки BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL E. coli (Agilent Technologies) трансформировали pMCSG7-His 6 -p38α и отбирали в среде Луриа-Бертани (LB), содержащей карбенициллин (100 мкг  мл -1 ). ), хлорамфеникол (15 мкг мл -1 ) и спектиномицин (50 мкг мл -1 ) при 37 °C до ОП 600  = 0.6–0,8. В этот момент клетки индуцировали 1 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) и выращивали при 25 °C в течение 14–16 часов. Осадки клеток собирали центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин, 4°С) и гомогенизировали в лизирующем буфере (10 мМ Трис, рН 8,3, 500 мМ NaCl, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 10 мМ имидазол и 10% глицерин), содержащем 1X коктейльная таблетка с ингибитором протеазы (Roche). Затем гомогенизированные клетки трижды пропускали через микрофлюидизатор при 15 000 PSI, а лизат очищали центрифугированием (16 000 об/мин, 45 мин, 4 °C).Затем полученный супернатант наносили на гранулы агарозы Ni-NTA (QIAGEN) при осторожном вращении в течение 1 часа при 4°C, один раз промывали лизирующим буфером с 10 мМ имидазолом (pH 8,3), дважды лизирующим буфером, содержащим 20 мМ имидазола (pH 8,3). 8.3) и элюировали с никелевой смолы буфером для лизиса, содержащим 50  мМ имидазола (рН 8,3). Элюированный белок оценивали на идентичность и чистоту с помощью окрашивания кумасси образца, прогоняемого на геле SDS-PAGE, а чистые элюаты объединяли, концентрировали и разбавляли в ионообменном буфере А (10 мМ Трис, рН 8.3, 5  мМ β-меркаптоэтанола) до тех пор, пока концентрация соли не станет 50 мМ, перед загрузкой на колонку Mono Q 5/50 GL (GE Life Sciences). Белок подвергали поэтапному протоколу промывки с последующим линейным градиентом от 200 до 500 мМ NaCl с использованием ионообменного буфера B (10 мМ Трис 8.3, 1 мМ NaCl, 5 мМ β-меркаптоэтанол). Затем фракции оценивали на чистоту с помощью кумасси, объединяли, концентрировали и пропускали через колонку HiLoad 16/600 Superdex-200 (GE Healthcare Life Sciences) с использованием эксклюзионного буфера (10 мМ трис, pH 8.3, 150 мМ NaCl, 5 мМ β-меркаптоэтанол). Чистые фракции p38α объединяли, концентрировали до ~5 мг мл -1 , разделяли на аликвоты и подвергали мгновенной заморозке перед хранением при -80°C.

Киназа p38δ человека дикого типа (эталонная последовательность NCBI: NM_002754.4), кодирующая область, охватывающую аминокислоты 1–365, была амплифицирована с помощью ПЦР на матрице pcDNA3.3-p38delta-MAPK (MAPK13), которую мы получили в подарок от Dr. , Romeo Ricci (IGBMC), описанный ранее 70 . Эту область p38δ клонировали в вектор pET28a, содержащий N-концевую метку His 6 , с использованием сайтов рестрикции Nhe I и Bam HI.Как и ранее, клетки BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL E. coli (Agilent Technologies) трансформировали pET28a-His 6 -p38delta и отбирали в среде LB, содержащей канамицин (50 мкг  мл -1 ), хлорамфеникол (15 мкг мл -1 ) и спектиномицин (50 мкг мл -1 ) при 37 °C до OD 600  = 0,8. Очистку His 6 -p38δ проводили идентично His 6 -p38α выше, за исключением того, что шарики агарозы Ni-NTA дважды промывали лизисным буфером с 20 мМ имидазолом (pH 8.3), один раз буфером для лизиса, содержащим 50 мМ имидазола (pH 8,3), и элюировали смолу, конъюгированную никелем, буфером для лизиса, содержащим 150 мМ имидазола (pH 8,3). Чистые фракции p38δ объединяли, концентрировали до ~ 3 мг мл -1 , разделяли на аликвоты и подвергали мгновенной заморозке перед хранением при -80°C.

Для экспрессии меченных GST VHL:Элонгин B:Элонгин C (обозначаемых здесь как GST-VHL) человеческий VHL дикого типа, элонгин B и элонгин C коэкспрессировали в E. coli . Клетки BL21(DE3) котрансформировали pBB75-элонгином C и pGEX4T-2-VHL-rbs-элонгином B и отбирали в среде LB, содержащей карбенициллин (100 мкг мл -1 ) и канамицин (25 мкг мл -1 ) при 37 °C до OD 600  = 0.8, после чего культуру охлаждали до 16 °С и индуцировали 0,4 мМ IPTG в течение 16 часов. Клетки гомогенизировали и лизировали, как описано выше, за исключением того, что буфер для лизиса состоял из 30 мМ Трис [рН 8,0], 200 мМ NaCl, 5% глицерина, 5 мМ ДТТ, содержащего коктейльную таблетку ингибитора протеазы 1X (Roche). Осветленный клеточный лизат наносили на гранулы глутатион-сефарозы 4B (GE Life Science) и осторожно вращали в течение 2 ч при 4°С. Гранулы промывали четырьмя колоночными объемами лизирующего буфера, а затем четырьмя колоночными объемами элюирующего буфера (50 мМ Трис, рН 8.0, 200 мМ NaCl, 10 мМ глутатиона). Элюированный белок оценивали на идентичность и чистоту с помощью окрашивания кумасси образца, прогоняемого на геле SDS-PAGE, а чистые элюаты объединяли, концентрировали и разбавляли в ионообменном буфере А (30 мМ Трис, рН 8,0, 5% глицерин, 1 мМ ДТТ). ) до тех пор, пока концентрация соли не станет 50 мМ, перед загрузкой на колонку Mono Q 5/50 GL (GE Life Sciences). Белок подвергали линейному градиенту NaCl (0–500 мМ NaCl) с использованием ионообменного буфера B (30 мМ Трис 8.0, 1 мМ NaCl, 5% глицерин, 1 мМ ДТТ).Затем фракции оценивали на чистоту с помощью кумасси, объединяли, концентрировали и пропускали через колонку Superdex-200 (GE Life Sciences) с использованием буфера для исключения размера (30 мМ трис, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 10% глицерин, 1 мМ ДТТ). . Чистые фракции GST-VHL объединяли, концентрировали до ~5 мг мл -1 , разделяли на аликвоты и подвергали мгновенной заморозке перед хранением при -80°C.

Трансфекции

Мутант p38δ был получен с помощью набора для направленного мутагенеза QuikChange Lightning (Agilent). Трансфекции проводили с использованием реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в клетках HeLa, высеянных в количестве 3 × 10 5 клеток на шесть лунок.На трансфекцию использовали один микрограмм pcDNA5-p38delta-WT или pcDNA5-p38delta-K220ET221E, содержащих FLAG. Среду Opti-MEM меняли через 6 часов на DMEM (1 × ), после чего добавляли указанные соединения на 24 часа перед сбором урожая.

Вытягивание тройного комплекса

Глутатион-сефарозу 4B (гранулы, конъюгированные с глутатионом, в суспензии, содержащей 20 % этанола) дважды промывали промывочным буфером 1X (50 мМ HEPES, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,01 % NP40). , 5  мМ MgCl 2 , 10% глицерина), а затем блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре с помощью 10% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в промывочном буфере.Затем гранулы снова трижды промывали промывочным буфером, а затем очищенный GST-VBC (стабильная форма VHL в комплексе с EloB/EloC, описанная выше) иммобилизовали в течение 1 ч при 4°C при 3,6 пмоль  мкл –1 гранул . Затем шарики трижды промывали промывочным буфером, ресуспендировали, делили на два равных объема и добавляли белок p38α или p38δ. Затем смесь гранул:p38 разделяли на аликвоты в отдельные пробирки и добавляли PROTAC в указанной концентрации (PROTAC были промежуточно разбавлены 10% ДМСО и 0.25% ГЛАВА). Эту смесь инкубировали при 4 °C в течение 2 часов. Гранулы трижды промывали 10 объемами колонок промывочного буфера, а затем элюировали загрузочным буфером SDS при 75°С в течение 10 мин.

Для экспериментов, в которых входной подложкой является WCL (рис. 4b), образец был приготовлен следующим образом. Пять 150-мм чашек с конфлюэнтными клетками MDA-MB-231 промывали 1X PBS, pH 7,4, а затем диссоциировали с использованием буфера для диссоциации клеток на основе PBS, не содержащего ферментов (ThermoFisher Scientific), в течение 10 мин при 37°C.Затем клетки осаждали, ресуспендировали в промывочном буфере (то же, что и выше, но с добавлением 1X коктейля ингибиторов протеазы (Roche) и 5 мкМ эпоксомицина), а затем лизировали ультразвуком (микронаконечник Branson sonicator, мощность = 6, рабочий цикл 50% в течение трех циклы 30 с включения и 1 мин выключения при 4 °C). Лизат очищали центрифугированием и затем добавляли к гранулам, конъюгированным с GST-VBC, в качестве входного субстрата, как указано выше.

Анализ тройного комплекса AlphaLISA

Анализы проводились при комнатной температуре, и планшеты закрывались прозрачной пленкой между добавлением реагентов для предотвращения загрязнения лунки.Все реагенты были разведены в 50 мМ HEPES pH 7,5, 50 мМ NaCl, 69 мкМ Brij-35 и 0,1 мг мл -1 BSA. Рекомбинантный GST-VBC смешивали с His 6 -p38α и PROTAC (разбавленный один к трем из 6-кратного стока) до конечного объема 15 мкл на лунку в микропланшете OptiPlate-384 (PerkinElmer) и инкубировали в течение 30 мин. VBC и p38α поддерживали при постоянной конечной концентрации 150 нМ. Всего в каждую лунку добавляли 7,5 мкл гранул акцептора Anti-6xHis AlphaLISA (PerkinElmer) и планшеты инкубировали в течение 15 минут в темноте.Всего в каждую лунку добавляли 7,5 мкл гранул донора альфа-глутатиона (PerkinElmer) и планшеты инкубировали в течение 45 минут в темноте. Планшеты считывали на устройстве для считывания микропланшетов Synergy 2 с использованием программного обеспечения для визуализации Gen5 (BioTek Instruments) с длиной волны возбуждения 680 нм и длиной волны излучения 615 нм. Значения интенсивности были нанесены на график в Graphpad Prism со значениями концентрации PROTAC, представленными в масштабе log10.

CETSA

Протокол CETSA адаптирован из 60 .В целом, 3 × 10 7 клеток MDA-MB-231 (1 × 10 7 клеток на условие) собирали и ресуспендировали в охлажденном на льду 1X PBS с добавлением 1X коктейля ингибиторов протеазы (Roche) и лизировали в течение трех циклов. мгновенного замораживания жидким азотом с последующим оттаиванием на 50% в водяной бане при комнатной температуре и дополнительным оттаиванием на 50% при 4 °C. После каждого цикла замораживания-оттаивания лизат кратковременно встряхивали для обеспечения однородного оттаивания. Затем лизат очищали в течение 20 минут центрифугированием (14000× г, при 4°C), а растворимую фракцию разделяли на три равные аликвоты.Аликвоты обрабатывали носителем (2,5% ДМСО), 100 мкМ SJFα или 100 мкМ SJFδ и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин при осторожном вращении. Затем каждую аликвоту делили (50 мкл) на восемь пробирок для ПЦР и отдельно нагревали при указанной температуре в течение 3 минут с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение 3 минут. После охлаждения образцы центрифугировали в течение 20 минут (14 000×  г при 4 °C), а супернатант (растворимая фракция) анализировали с помощью SDS-PAGE и проводили иммуноблотинг на p38δ и альфа-тубулин (отрицательный контроль).

SPR

Эксперименты SPR проводились на приборе Biacore 3000 (GE Healthcare) при комнатной температуре. Антитело GST было иммобилизовано путем прямого аминирования на поверхности карбоксиметилированного декстрана (CM5), и GST-VBC был захвачен на поверхности CM5. Эту подготовленную поверхность уравновешивали в течение 3 часов в рабочем буфере (10 мМ буфера HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,4 мг мл -1 BSA, 0,005% P2O, 2% ДМСО). Все соединения были приготовлены в планшетах со 100% ДМСО с максимальной концентрацией 500 мкМ в 3-кратном серийном разведении.Соединения переносили из планшета с запасом в планшет для анализа и разбавляли в рабочем буфере без ДМСО. В лунки с соответствующим соединением добавляли эквимолярную концентрацию целевого белка. Все соединения анализировали как серию концентраций по 12 точкам с конечной максимальной концентрацией анализа 50 мкМ для измерения связывания p38δ:PROTAC и VHL:PROTAC и максимальной концентрацией 5 мкМ для измерения связывания p38δ:PROTAC:VHL. Все соединения вводили в течение 60 с и позволяли диссоциировать в течение 300 с. Анализ данных проводили в программе Scrubber 2 (BioLogic Software).Пробелы из эталонной проточной кюветы, содержащей иммобилизованный GST-VBC, были вычтены, чтобы скорректировать шум, и данные были скорректированы с помощью растворителя относительно стандартной кривой ДМСО. Все зарегистрированные значения K d представляют собой среднее значение как минимум двух повторов и были получены путем подбора минимум пяти концентраций с использованием алгоритма подбора 1:1.

Анализы убиквитинирования

Клетки HeLa (2 × 10 6 ) высевали в чашки диаметром 10 см и оставляли прилипать на ночь.На следующий день клетки трансфицировали 3 мкг pcDNA5-FLAG-p38α или pcDNA5-FLAG-p38δ и 1 мкг pRK5-HA-Ubiquitin-WT (плазмида Addgene № 17608) в среде Opti-MEM с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Через 6 часов среду Opti-MEM заменяли средой DMEM (1 × ) и клетки выращивали еще 24 часа. По истечении этого времени клетки обрабатывали указанными концентрациями либо носителя (ДМСО), либо PROTAC в течение указанного периода времени при 37°С. Затем клетки помещали на лед, дважды промывали ледяным 1X PBS и лизировали в 500 мкл модифицированного 1X RIPA-буфера (25 мМ Tris-HCl, pH 7.6, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS), содержащий 5 мМ моногидрата 1,10-фенантролина, 10 мМ N -этилмалеимида, 20 мкМ PR-619 и 1X смесь ингибиторов протеазы. (Рош). Лизаты центрифугировали при 14000 ×  г при 4 °C в течение 20 минут и измеряли содержание белка с помощью анализа белка Pierce BCA (ThermoFisher Scientific). Белковый лизат нормализовали, и 1 мг лизата аликвотировали на 20 мкл (объем слоя) гранул DYKDDDDK-сефарозы (CST: #70659). Белки, содержащие FLAG, подвергали иммунопреципитации из лизатов HeLa в течение ночи при 4°С с легким вращением, после чего образцы центрифугировали при 3000× г при 4°С в течение 2 мин, а гранулы однократно промывали ледяным буфером для лизиса и три раза ледяным раствором 1X TBS-T (137  мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 19 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,02% твин 20). Гранулы ресуспендировали в 1X буфере для образцов додецилсульфата лития (LDS), содержащем 5% 2-меркаптоэтанола (BME). Иммунопреципитированный белок элюировали с шариков путем нагревания при 95°С в течение 5 мин, а супернатант помещали в гель SDS-PAGE и оценивали на наличие иммунопреципитированных белков, меченных FLAG (анти-FLAG M2, Sigma # F1804), а также убиквитинированные FLAG-меченые белки (анти-HA-метка (6E2), CST #2367). WCL относится к нормализованному входному лизату, загруженному на гранулы DYKDDDDK-сефарозы.

Эксперименты по иммунопреципитации TUBE1 проводили точно так же, как описано выше, за исключением того факта, что 1 мг нормализованного лизата HeLa загружали на 20 мкл агарозной смолы TUBE1 (LifeSensors) на образец.

Количественная ПЦР в реальном времени

Клетки MDA-MB-231 высевали в количестве 3 × 10 5 клеток на лунку в шестилуночный планшет, оставляли прикрепляться и обрабатывали либо носителем (ДМСО), либо PROTAC ( 250 нМ) в течение 24 часов. Клетки лизировали в 1 мл реагента TRIzol (ThermoFisher Scientific) на шесть лунок.Добавляли хлороформ (200 мкл) на образец, после чего образцы энергично встряхивали в течение 15 с и центрифугировали при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C. Затем тотальную РНК осаждали из водной фазы добавлением изопропанола (500 мкл) с последующим центрифугированием при 12000× г в течение 10 минут при 4 °C. Осадок РНК дважды промывали 75% EtOH и сушили на воздухе в течение 15 мин, после чего РНК растворяли в 25 мкл не содержащей нуклеазы H 2 O. Комплементарную ДНК синтезировали из 4 мкг тотальной РНК в соответствии с условиями протокол производителя (Applied Biosystems) и ПЦР в реальном времени проводили с 800 нМ праймеров, разведенных 4 мкл SYBR Green Reaction Mix (Applied Biosystems).Эксперименты ОТ-ПЦР проводились по следующему протоколу на LightCycler 480 Instrument II (Roche): 95°С в течение 10 мин, 40 циклов при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 45 с. Образцы qRT-PCR были выполнены и проанализированы в трех экземплярах из двух независимых экспериментов. Для нормализации использовали бета-тубулин . Праймеры, используемые в данном исследовании, являются следующие:

Beta_Tub_F: 5′-TGGACTCTGTTCGCTCAGGT-3′

Beta_Tub_R: 5′-TGCCTCCTTCCGTACCACAT-3′

p38α_F: 5′-TCGCATGAATGATGGACTGAAAT-3′

p38α_R: 5′-CCCGAGCGTTACCAGAACC-3′

p38δ_F: 5′ -TGAGCCGACCCTTTCAGTC-3′

p38δ_R: 5′-AGCCCAATGACGTTCTCATGC-3′.

CHX-чейз-анализ

Клетки MDA-MB-231 высевали в количестве 3 × 10 5 клеток на лунку в шестилуночной чашке, оставляли прикрепляться на ночь и заменяли на бессывороточный RPMI-1640 (1 × ) СМИ в течение 16 ч. Затем клетки предварительно обрабатывали CHX (Sigma) в концентрации 100 мкг мл -1 в течение 1 часа перед добавлением либо носителя (ДМСО), либо PROTAC (250 нМ). В указанные моменты времени клетки немедленно помещали на лед, промывали 1X PBS, лизировали и кипятили.

Анализ вымывания PROTAC

Клетки MDA-MB-231 высевали при 1.5 × 10 5 клеток на лунку в чашке с шестью лунками и оставляли прикрепляться на ночь. На следующий день все клетки обрабатывали либо носителем (ДМСО), либо PROTAC (250 нМ). Через 24 часа клетки либо собирали, либо промывали 1X PBS, обрабатывали трипсином и повторно высевали на новые шестилуночные чашки в свежей среде RPMI-1640 (1 × ) без дополнительного соединения. Для этих условий вымывания клетки собирали каждые 24 часа до окончательного сбора (72 часа вымывания).

Моделирование МД

Начальные координаты для p38δ получены из кристаллической структуры, загруженной из записи Protein Data Bank (PDB) .Чтобы заменить лиганд в этой структуре на форетиниб, использовали запись PDB 5IA4 путем наложения его белковой основы на структуру 4EYJ, переноса форетиниба в структуру 4EYJ и замены исходного лиганда. Полученный комплекс p38δ-форетиниб был подвергнут программе Protein Preparation Wizard of Maestro 2016-3, доступной от Schrodinger Inc. (Нью-Йорк, штат Нью-Йорк), с помощью которой были добавлены атомы водорода, построены недостающие боковые цепи и проведено протонирование. состояния были назначены, предполагая рН 7.0 для ионизируемых групп. Энергетическая минимизация комплекса проводилась на 500 шагов.

Начальные координаты для VHL взяты из записи PDB 4W9H. Начальные координаты для тримера p38δ:PROTAC:VHL получали следующим образом. (1) Электростатическая поверхность была создана для комплекса p38δ-лиганд и комплекса лиганда VHL соответственно. (2) Было установлено, что комплекс лиганда VHL имеет различное относительное расположение по отношению к комплексу p38δ-лиганд таким образом, что гидрофобный участок поверхности лиганда VHL противостоит различным гидрофобным участкам и бороздам поверхности p38δ-лиганда, таким образом создавая различные начальные режимы с точки зрения относительного расположения между p38δ и VHL.(3) Для каждого начального режима был построен линкер для соединения форетиниба и лиганда VHL и формирования полного PROTAC. И (4) минимизация энергии 500 шагов была выполнена для каждой начальной точки тримера.

Силовое поле OPLS3 использовалось на всех этапах расчета. Параметры торсионного угла были исследованы с помощью программы Force Field Builder и обнаружили, что торсионные углы между амидной и циклопропильной группой и между фторфенильной группой и атомом эфира кислорода, присоединенным к хинолиновой группе в форетинибе, нуждаются в коррекции; Таким образом, были созданы новые профили кручения, соответствующие профилям, данным квантово-механическими расчетами Jaguar.

Каждую начальную точку тримера p38δ:PROTAC:VHL подвергали моделированию методом МД. Настройка системы производилась с помощью программы System Builder of Maestro, в которой использовалось периодическое граничное условие; форма ящика была кубической, причем абсолютный размер каждой стороны превышал наибольший размер системы на 5 Å. Добавлены явные воды. Систему нейтрализовали ионами натрия и хлорида и подсолили до ионной силы 0,15 М. MD был сделан с помощью Desmond Multisim версии 3.8.5.19, состоявший из восьми этапов: (1) задача; (2) моделирование 100 пикосекунд с броуновской динамикой NVT с T при 10 K, малыми временными шагами и ограничениями на тяжелые атомы растворенных веществ; (3) моделирование 12 пикосекунд, ансамбль NVT, T при 10 K, малые временные шаги и ограничения на тяжелые атомы растворенного вещества; (4) моделирование 12 пикосекунд, ансамбль NPT, T при 10 K и ограничения на тяжелые атомы растворенного вещества; (5) сольватация незаполненных карманов; (6) моделирование 12 пикосекунд до целевой температуры 310 K, ансамбль NPT и ограничения на тяжелые атомы растворенного вещества; (7) моделирование 24 пикосекундного ансамбля NPT без ограничений при температуре 310 K; и, наконец, (8) производственный цикл 100 наносекунд.Во время производственного цикла кадры координат сохранялись каждые 10 пикосекунд. На соответствующих этапах целевое давление было установлено на уровне 1,01325 бар.

Постсимуляционный анализ после каждого прогона выполнялся следующим образом. Были извлечены последние 20 наносекунд кадров траектории. Был проведен кластерный анализ с использованием метода иерархической кластеризации. Расстояние между любыми двумя элементами (кадрами) представляло собой среднеквадратичное отклонение тяжелых атомов растворенного вещества между элементами после их наложения.Расстояние отсечки составляло 2 Å. Использовался каждый кадр. Структура, ближайшая к центроиду каждого кластера, была записана как репрезентативная структура этого кластера. Репрезентативная структура самого большого кластера для каждого моделирования МД считалась репрезентативной структурой этого прогона моделирования. Такую структуру можно считать самой посещаемой конформацией этого пробега.

Моделирование MD было выполнено с использованием больших экземпляров облачных машин Amazon Web Service размером g2,2 × .Код Desmond с поддержкой графического процессора использовался и в основном выполнялся с использованием графического процессора.

Химические синтезы

Подробности о химических синтезах PROTAC можно найти в дополнительной информации в качестве дополнительного примечания 1.

Количественный анализ и статистический анализ 2, 6 и дополнительные рисунки 2, 3 были количественно определены с использованием функции полосы в Image Lab (Bio-Rad). Значения p38 были нормализованы по сигналу α-тубулина для учета различий в белковой нагрузке, а нормализованные значения, обработанные PROTAC, были выражены в % от значения, обработанного носителем (без PROTAC), которое само было определено как 100% белка p38. уровень.Затем эти данные были представлены в виде графика и сопоставлены с сигмоидальной кривой с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения для подбора данных Prism (Graphpad Prism). Сигмоидальная аппроксимация установила как полную степень деградации, или

D max в нижней асимптоте кривой, так и DC 50 , которая является точкой перегиба, в которой было 50% наблюдаемой общей деградации. достиг.

Сводка отчета

Дополнительную информацию о планах эксперимента можно найти в Сводке отчета об исследованиях в природе, связанной с этой статьей.

Электрофорез в агарозном геле: оборудование и процедура – ​​видео и стенограмма урока

Коробка с гелем и блок питания

После отливки этот гель помещается внутрь устройства, называемого коробкой для геля. Электрод — один положительный и один отрицательный — находится на каждом конце гелевой коробки. Лунки всегда ориентированы так, чтобы они были дальше от положительного электрода. Это гарантирует, что молекулы ДНК в лунке должны проходить через большую часть агарозного геля, что обеспечивает достаточное время для разделения.

Температура духовки 66 ° C 66 ° C
Буферная температура 35 ° C
PRERUN Напряжение 15 kv
Время предварительного запуска 180 с
Напряжение подачи 2.0 KV
впрыскное время 5 S
15 кВ
Устойчивость тока 30 мкА
30 мкА
Противоположно заряженные электроды расположены на каждом конце гелевой коробки.

Воздух плохо проводит электричество, поэтому мы покрываем гель буфером для электрофореза. Буфер для электрофореза представляет собой солевой раствор. Это не поваренная соль, но ионы соли могут нести электрический заряд, как и соленая вода. Соль в буфере для электрофореза замыкает цепь между положительным и отрицательным электродами.

Когда электроды гелевой коробки подключены к источнику питания, электричество проходит через электрическую цепь, заставляя отрицательно заряженные молекулы ДНК перемещаться в гель агарозы. Молекулы ДНК продолжают двигаться через агарозу к положительному электроду, пока присутствует электрический ток. Напомним, что более короткие молекулы ДНК проходят через агарозу быстрее, чем более длинные молекулы ДНК. Таким образом, электрофорез в агарозном геле разделяет различные фрагменты ДНК в зависимости от размера.

Загрузочный буфер и передний краситель

Напомним, что мы используем другой тип буфера, называемый загрузочным буфером, в образцах ДНК. Загрузочный буфер придает образцам ДНК цвет и плотность, поэтому их можно вставлять в лунки геля.

После загрузки образцов электрический ток, подаваемый источником питания, перемещает через гель не только образцы ДНК, но и молекулы красителя. Обратите внимание на появившиеся цветные линии. Эти линии не представляют собой фрагменты ДНК.Эти линии представляют собой краситель в загрузочном буфере, который использовался для визуализации образцов на этапе загрузки.

Загрузочный буфер добавляют к образцам ДНК.

Самая быстро движущаяся линия красителя обычно называется фронтом красителя. Поскольку ДНК невидима до этапа окрашивания бромистым этидием, это представляет собой вторую функцию загрузочного буфера — средства отслеживания хода экспериментов по электрофорезу.Ученые используют фронт красителя как средство гарантии того, что ДНК, которую они хотят проанализировать, случайно не оторвется от конца геля. Как правило, выбирается краситель, который работает быстрее, чем фрагменты ДНК. Следовательно, пока краситель все еще виден, ДНК все еще находится в агарозном геле.

Бромид этидия и УФ-бокс

После завершения анализа агарозный гель можно вынуть из бокса и погрузить в раствор бромистого этидия. Напомним, что бромистый этидий используется для визуализации ДНК.Молекулы бромистого этидия интеркалируют или вставляются между азотистыми основаниями в молекуле ДНК.

Поскольку бромистый этидий флуоресцирует при воздействии ультрафиолетового света, гель необходимо поместить в УФ-бокс для визуализации фрагментов ДНК. Чтобы защитить себя от ультрафиолетового излучения, ученые обычно смотрят на гель через стеклянный экран или надевают защитные очки.

Обратите внимание, что все фрагменты ДНК одинакового размера выглядят как одна флуоресцирующая полоса в геле. Чем больше молекул аккумулируется в одном и том же месте геля, тем толще и ярче будет полоса.

Гель помещают в УФ-бокс, чтобы можно было визуализировать фрагменты ДНК.
Leave a Reply

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.