Кислота глицирретиновая: Применение глицирризиновой кислоты, каким действием обладает глицирризиновая кислота в терапии болезней печени

Содержание

Применение глицирризиновой кислоты, каким действием обладает глицирризиновая кислота в терапии болезней печени

Глицирризиновая кислота (ГК) – противовоспалительное средство с противовирусной активностью растительного происхождения. Применяется в составе различных лекарственных препаратов, в том числе гепатопротекторов. Глицирризиновая кислота содержится в корне солодки. Это растительное средство успешно используется в медицине свыше 3 000 лет. Эффективность и профиль безопасности ГК при применении для профилактики и терапии заболеваний печени хорошо изучены. В России доступно сочетание глицирризиновой кислоты и фосфолипидов под торговым названием Фосфоглив®.

Каким действием обладает глицирризиновая кислота

В ходе экспериментальных исследований было доказано, что ГК обладает противовоспалительным, антиоксидантным и антифиброгенным действием. ГК может подавлять репликацию вирусов за счет стимуляции активности интерферонов.

Какого эффекта позволяет добиться применение глицирризиновой кислоты в терапии болезней печени

При заболеваниях печени препараты с глицирризиновой кислотой влияют непосредственно на сам фактор, вызывающий повреждение клеток, – воспаление, – улучшают регенерацию тканей, а также предупреждают перерождение функциональных структур органа в соединительную ткань (развитие фиброза). Это подтверждается данными научных исследований.

Уменьшение воспаления печени. В ходе рандомизированного клинического исследования применения глицирризиновой кислоты у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени было установлено, что данное вещество достоверно уменьшает выраженность воспаления. Клинически это проявляется снижением уровней аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ). Такой же эффект применения ГК был выявлен у пациентов с алкогольной болезнью печени. Это подтверждают данные 12 клинических исследований, в которых приняли участие более 800 человек.

Снижение риска осложнений болезней печени. Длительное (многолетнее) введение глицирризиновой кислоты больным с хроническим гепатитом С (ХГС), которых невозможно излечить противовирусными препаратами, уменьшает вероятность развития наиболее опасного осложнения – первичного рака печени. Это было установлено в ходе ретроспективного исследования, участниками которого стали 1249 пациентов с неизлечимым ХГС.

Уменьшение степени фиброза. Применение ГК у больных с хроническим гепатитом С также позволяет снизить накопление соединительной ткани в печени. Это подтверждают данные рандомизированного исследования 436 пациентов с ХГС, которые получали ГК после неэффективной противовирусной терапии.

Как применять препараты глицирризиновой кислоты

Режим дозирования и курс лечения ГК подбираются врачом индивидуально, зависят от конкретного препарата, стадии заболевания печени и других факторов. При возникновении симптомов поражения гепатобилиарной системы (появлении тяжести в правом подреберье, вздутия живота и т. д.) необходимо проконсультироваться со специалистом. Курс лечения должен проводиться строго в соответствии с инструкцией по медицинскому применению глицирризиновой кислоты и рекомендациями врача.

Когда нельзя применять глицирризиновую кислоту

Вне зависимости от торгового названия глицирризиновая кислота должна применяться при наличии соответствующих показаний и после консультации с врачом. Только специалист может оценить целесообразность и безопасность использования ГК для лечения и профилактики заболеваний печени. В любом случае основным противопоказанием к применению таких препаратов является гиперчувствительность к ГК.

Глицирризиновая кислота в составе препарата Фосфоглив®

В состав препарата Фосфоглив® входят глицирризиновая кислота и фосфолипиды. Благодаря такому сочетанию средство обладает комплексным гепатопротекторным, мембраностабилизирующим и противовирусным эффектом. ГК устраняет воспаление – универсальную внутреннюю причину поражения печени, т. е. препятствует воздействию основного повреждающего фактора. Второй активный компонент – фосфатидилхолин (действующее вещество эссенциальных фосфолипидов) – помогает восстановить функциональные клетки органа – гепатоциты. Фосфоглив® показан к применению при жировой дегенерации печени, алкогольном, токсическом и лекарственном поражении органа, в комплексной терапии гепатитов и цирроза.


Ипатова О.М. Фосфоглив: механизм действия и применение в клинике. Под ред. академика РАМН Арчакова А.И. М.: Изд. ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН, 2005. с. 318.1

Ali Akbar Hajiaghamohammadi, Amir Ziaee, Rasoul Samimi. The Efficacy of Licorice Root Extract in Decreasing Transaminase Activities in Non-alcoholic Fatty Liver Disease: A Randomized Controlled Clinical Trial // Phytotherapy Research. 2012; 26 (9): 1381–1384.2

Community herbal monograph on Glycyrrhiza glabra L. and/or Glycyrrhiza inflata Bat. and/or Glycyrrhiza uralensis Fisch., radix. Committee on Herbal Medicinal Products (HMPC). 22 May 2012. EMA/HMPC/571119/2010.3

Kenji Ikeda, Yasuji Arase, Masahiro Kobayashi et al. A Long-Term Glycyrrhizin Injection Therapy Reduces Hepatocellular Carcinogenesis Rate in Patients with Interferon-Resistant Active Chronic Hepatitis C: A Cohort Study of 1249 Patients // Digestive Diseases and Sciences. 2006; 51 (3): 603–609.4

M. P. Manns, H. Wedemeyer, A. Singer et al. Glycyrrhizin in patients who failed previous interferon alpha-based therapies: biochemical and histological effects after 52 weeks // Journal of Viral Hepatitis. 2012; 19: 537–546.

5

Masao Omata, Tatsuo Kanda, Ming-Lung Yu et al. APASL consensus statements and management algorithms for hepatitis C virus infection // Hepatol Int. DOI 10.1007/s12072-012-9342-y.6

Meng Wei,Yu Liang-zhu,Wang Li. Effects of Compound Glycyrrhizin on Liver Function in Patients with Alcoholic Liver Diseases: a Meta-analysis // China Pharmacy. 2013; 24 (12): 1116-1118.7

Tekla GJ Van Rossum, Arnold G Vulto, Wim CJ Hop et al. Intravenous glycyrrhizin for the treatment of chronic hepatitis C: a double blind, randomized, placebo-controlled phase I/II trial // Journal of gastroenterology and hepatology. 1999; 14: 1093-1099.

8

Глицирризиновая кислота — описание вещества, фармакология, применение, противопоказания, формула

Содержание

Структурная формула

Русское название

Глицирризиновая кислота

Английское название

Glycyrrhizinic acid

Латинское название вещества Глицирризиновая кислота

Acidum glycyrrhizinicum (род. Acidi glycyrrhizinici)

Брутто формула

C42H62O16

Фармакологическая группа вещества Глицирризиновая кислота

Фармакологическое действие

Фармакологическое действие противовирусное.

Фармакология

Ингибирует фосфокиназу и останавливает фосфорилирование клеточных и кодируемых вирусом белков в инфицированных клетках. Инактивирует вирусы вне клеток, при этом вирусы опоясывающего лишая и простого герпеса — необратимо. Блокирует внедрение активных вирусных частиц внутрь клетки и нарушает способность вируса к синтезу новых структурных компонентов.

При местном применении обладает высокой тропностью к клеткам, инфицированным вирусом, и накапливается в очагах поражения. Системная абсорбция происходит медленно.

Применение вещества Глицирризиновая кислота


Вирусные инфекции половых органов, вызванные вирусом Herpes simplex (тип 2), кожи и слизистых полости рта, носа и т.д. (вирусы Herpes simplex 1 и 2 типа), опоясывающий лишай; профилактика вирусных инфекций, передающихся половым путем.

Противопоказания

Гиперчувствительность.

Побочные действия вещества Глицирризиновая кислота

Аллергические реакции.

Взаимодействие

Усиливает (взаимно) эффект других противовирусных препаратов.

Способ применения и дозы

Спрей: наружно — распыляют (в течение нескольких секунд с расстояния 4–5 см) на пораженную поверхность 6 раз в сутки в течение 5 (до 10) дней; вагинально — 3–4 раза в сутки в течение 7–10 дней (повторно через 10 дней).

Крем: наносят на пораженную поверхность 3–5 раз в сутки.

Меры предосторожности

В случае нагноения или появления неприятного запаха следует обратиться к врачу. При признаках раздражения лечение прекращают.

Торговые названия с действующим веществом Глицирризиновая кислота

Как глицирризиновая кислота улучшает проницаемость клеточных мембран

Ученые из Института химической кинетики и горения им. В. В. Воеводского СО РАН исследуют механизмы, с помощью которых глицирризиновая кислота улучшает проницаемость клеточных мембран. Результаты работы могут быть перспективны для разработки новых способов доставки лекарственных средств, рассказывает сайт

Наука в Сибири.

Глицирризиновая кислота добывается из корня солодки, который многие сотни лет применяется в народной медицине России, Китая и других стран. Ранее ученые из нескольких сибирских институтов в совместной работе показали, что глицирризиновая кислота не только обладает собственной биологической активностью, но и может усиливать действие других препаратов при их совместном применении. Это вещество оказалось способным образовывать супрамолекулярные комплексы со множеством препаратов.

Сейчас же ученые поставили задачу объяснить этот эффект. Сотрудница лаборатории магнитных явлений ИХКГ СО РАН Ольга Селютина изучила взаимодействие глицирризиновой кислоты с холестерином. Было установлено, что с холестерином эта кислота тоже может образовывать комплексы включения, и появился вопрос, способна ли она посредством извлечения холестерина воздействовать на свойства самих мембран. Для ответа на этот вопрос была исследована эластичность и проницаемость клеточных мембран.

«Мы увидели, что в присутствии глицирризиновой кислоты маленькие молекулы, в частности ионы формиата натрия, проходят через клеточную мембрану быстрее, чем в ее отсутствие, при этом сама мембрана становится более ”мягкой”», — объяснила Ольга Селютина.

Ученые также исследовали, как глицирризиновая кислота влияет на подвижность липидов клеточной мембраны. Они предположили, что влияние кислоты на пластичность и проницаемость происходит за счет того, что она может каким-то образом либо извлекать холестерин, либо сама встраиваться в мембрану. Посмотрев, как в ее присутствии изменяется подвижность липидов, ученые обнаружили, что и «головы», и «хвосты» становятся менее подвижными. Глицирризиновая кислота проникает в наружный полуслой мембраны, и в результате происходит образование неких структур, через которые могут легче проходить ионы.

На сегодняшний день новосибирскими учёными исследован целый ряд комплексов глицирризиновой кислоты с разными лекарствами: средствами от давления, антигельминтными и противовоспалительными препаратами. Показано, что это вещество выступает неким универсальным инструментом, имеющим большие перспективы. Глицирризиновая кислота образует растворимые комплексы с нерастворимыми лекарствами плюс воздействует на клеточные мембраны, улучшая их проницаемость.

Код ТН ВЭД 2938903000. Кислота глицирризиновая и глицирризинаты. Товарная номенклатура внешнеэкономической деятельности ЕАЭС

Позиция ТН ВЭД
  • 28-38

    VI. Продукция химической и связанных с ней отраслей промышленности (Группы 28-38)

  • 29

    Органические химические соединения

  • XII. ГЛИКОЗИДЫ И АЛКАЛОИДЫ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ПРИРОДНЫЕ ИЛИ СИНТЕЗИРОВАННЫЕ, ИХ СОЛИ, ПРОСТЫЕ И СЛОЖНЫЕ ЭФИРЫ И ПРОЧИЕ ПРОИЗВОДНЫЕ

  • 2938 …

    Гликозиды, природные или синтезированные, их соли, простые и сложные эфиры и прочие производные

  • 2938 9 …

    прочие

  • 2938 90 300 0

    глицирризиновая кислота и глицирризинаты


Позиция ОКПД 2
  • 21.10.53

    Гликозиды, алкалоиды растительного происхождения, их соли, простые и сложные эфиры и прочие производные

Таможенные сборы Импорт
Базовая ставка таможенной пошлины 5%
реш.80
Акциз Не облагается
НДС

Жизненно необходимая медтехника

Гликозиды.. (НДС Лек.средства):

Постановление 688 от 15.09.2008 Правительства РФ

 

10% — Лекарственные средства (Регистрационное удостоверение)

20% — Прочие

 

Освобождение и льготы

Органические химические соединения (НДС Прод.товары):

Постановление 908 от 31.12.2004 Правительства РФ

 

10% — сахарозаменители для людей, больных сахарным диабетом, для использования в пищевых целях и кормовых целях (в том числе предназначенных для проведения сертификационных испытаний, проверок, экспериментов)

20% — прочие

Экспорт
Базовая ставка таможенной пошлины Беспошлинно
Акциз Не облагается

Рассчитать контракт

Особенности товара

Загрузить особенности ИМ Загрузить особенности ЭК

Случай гипокалиемического паралича на фоне приема терапевтических доз препарата, содержащего корень солодки | Василенко

1. Кейзер Н.П., Жарский С.Л., Богатков С.Д. и др. Случай гипокалиемии и рабдомиолиза при хроническом отравлении солодкой. Дальневосточный медицинский журнал 2015;5:78–81.

2. Супонева Н.А., Пирадов М.А., Никитин С.С. и др. Острый гипокалиемический паралич вследствие передозировки препарата, содержащего корень солодки. Анналы клинической и экспериментальной неврологии 2008;2(1):47–50.

3. Meltem A.C., Figen C., Nalan M.A. et al. A hypokalemic muscular weakness after licorice ingestion: a case report. Cases J 2009;2:8053. DOI: 10.1186/1757-1626-0002-0000008053. PMID: 20181204.

4. Peninkilampi R., Eslick E.M., Eslick G.D. The association between consistent licorice ingestion, hypertension and hypokalemia: a systematic review and meta-analysis. J Hum Hypertens 2017: 31(11):1–9. DOI: 10.1038/jhh.2017.45. PMID: 28660884.

5. Чернявский В.В., Сизенко А.К., Гвоздецкая Л.С. Воспаление при хронических заболеваниях печени и возможные подходы к лечению. Гастроэнтерология 2014;1(51):111–6.

6. Food, U.S. GRAS status of licorice (Glycyrrhiza), ammoniated glycyrrhizin and monoammonium glycyrrhizinate. Federal Register 1985:5099.

7. Kirusu S., Inoue I., Kawagoe T. et al. Clinical profile of patients with symptomatic glycyrrhizin-induced hypokalemia. Letters to the editor 2008;56:1579–80. DOI: 10.1111/j.1532-5415.2008.01781.x. PMID: 18808610.

8. Nazari S., Rameshrad M., Hosseinzadeh H. Toxicological effects of Glycyrrhiza glabra (Licorice): a review toxic effect. Phytother Res 2017;31:1635–50. DOI: 10.1002/ptr.5893. PMID: 28833680.

9. Супонева Н.А., Никитин С.С., Пирадов М.А. Особенности осмотра пациента, дифференциальная диагностика и самые частые причины острого вялого тетрапареза. Нервно-мышечные болезни 2011;1:5–13.

Опыт применения глицирризиновой кислоты при доброкачественных изменениях шейки матки

Волгоградский государственный медицинский университет ООО Лечебно-диагностическая клиника «Авиценна»

Цель исследования. Оценка эффективности длительного применения препарата глицирризиновой кислоты (эпиген-интим спрей) в лечении женщин с доброкачественными изменениями шейки матки и наличием признаков инфекции гениталий.
Материал и методы. В проведенное нами исследование были включены 69 сексуально активных женщин 18–25 лет. Обследование включало осмотр, кольпоскопию, исследование на ИППП, ВПЧ-тестирование, изучение микробиоценоза. Критерием отбора в группу было обнаружение у пациенток изменений на шейке матки, трактуемых при кольпоскопическом исследовании как эктопия и зона трансформации.
Результаты исследования. Результатом длительного применения препарата глицирризиновой кислоты стало значительное уменьшение клинических жалоб и выраженности атипических кольпоскопических изменений, не связанных с ПВИ.
Заключение. Проведенное исследование доказывает необходимость применения такого средства, как глицирризиновая кислота (наряду с барьерными методами контрацепции) для профилактики ИППП и вирус-ассоциированных заболеваний у молодых женщин. Также доказана эффективность длительного применения данного препарата для предупреждения рецидива после этиотропной терапии по поводу инфекционного процесса нижних отделов гениталий, особенно при обнаружении у пациентки доброкачественных изменений шейки матки.

доброкачественные поражения шейки матки

воспаление

папилломавирусная инфекция

глицирризиновая кислота

  1. Программа скрининга рака шейки матки. Клинический протокол. Проект. StatusPraesens. 2012; 4(10): 59–63.
  2. Научные материалы V Общероссийского научно- практического семинара «Репродуктивный потенциал России: версии и контраверсии». Сочи, 8–11 сентября 2012 года. М.: Изд-во StatusPraesens; 2012. 28 с.
  3. Moscicki A.B., Von Knebel Doeberitz M., Wentzensen N. Department of Pediatrics, University of California, San Francisco, USA, 2010.
  4. Короленкова Л.И. Влияние сексуального поведения девочек-подростков на риски раннего развития предрака и рака шейки матки. В кн.: Национальный и международный опыт охраны репродуктивного здоровья девочек: I научно-практическая конференция с международным участием. Москва, 4–7 июня 2013 года. М.; 2013: 77.
  5. Кумыкова З.Х., Уварова Е.В., Ежова Л.С. и др. Особенности состояния шейки матки у девочек-подростков с нарушением ритма менструаций. В кн.: Национальный и международный опыт охраны репродуктивного здоровья девочек: I научно-практическая конференция с международным участием. Москва, 4–7 июня 2013 года. М.; 2013: 91.
  6. Роговская С.И. Практическая кольпоскопия. 3-е изд. М.: ГОЭТАР-Медиа; 2012. 240 с.
  7. Fiore C., Eisenhut M., Krausse R., Ragazzi E., Pellati D., Armanini D., Bielenberg J. Antiviral effects of Glycyrrhiza species. Phytother. Res. 2008; 22(2): 141–8.
  8. Gao X., Wang W., Wei S., Li W. Review of pharmacological effects of Glycyrrhiza radix and its bioactive compounds. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2009; 34(21): 2695–700.
  9. Long D.R., Mead J., Hendricks J.M., Hardy M.E., Voyich J.M. 18β – Glycyrrhetinic acid inhibits methicillin – resistant Staphylococcus aureus survival and attenuates virulence gene expression. Antimicrob. Agents Chemother. 2013; 57(1): 241–7.
  10. Шаргородская А.В. Вирусные войны: стратегический потенциал. StatusPraesens. 2013; 1(12): 62–6.
  11. Роговская С.И., Шаргородская А.В., Бебнева Т.Н. Повышение эффективности лечения заболеваний шейки матки: изучение опыта применения глицирризиновой кислоты. Российский вестник акушера-гинеколога. 2011; 5: 98–101.
  12. Ордиянц И.М. Новые свойства глицирризиновой кислоты в акушерстве и гинекологии. StatusPraesens. 2009; 1(2): 73–5.

 

Об авторах / Для корреспонденции
Ткаченко Людмила Владимировна, заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии ФУВ ВолгГМУ
Адрес: 400131, Россия, Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1. Телефон: 8 (8442) 34-11-05. E-mail: [email protected]
Крапивина Марина Александровна, ассистент кафедры акушерства и гинекологии ФУВ ВолгГМУ
Адрес: 400131, Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1. Телефон: 8 (8442) 34-11-05. E-mail: [email protected]

Проницательные и проницаемые | Наука в Сибири

Учёные из Института химической кинетики и горения им. В. В. Воеводского СО РАН исследуют механизмы, с помощью которых глицирризиновая кислота улучшает проницаемость клеточных мембран. Результаты работы могут быть перспективны для разработки новых способов доставки лекарственных средств.

«В конце 1990-х — начале 2000-х годов, когда во всём мире начали бурно развиваться нанотехнологии, в медицине активно шёл поиск новых форм лекарственных препаратов повышенной эффективности и безопасности. При переходе в наномир требовались совсем другие методы,  но ни у биологов, ни у медиков их на тот момент не было. Тут как раз потребовались знания и опыт физиков», — рассказывает ведущий научный сотрудник лаборатории магнитных явлений ИХКГ СО РАН доктор химических наук Николай Эдуардович Поляков.

 

В это время в новосибирском Академгородке под руководством академика Генриха Александровича Толстикова стартовал интеграционный проект, объединивший усилия представителей разных наук для создания  с использованием нанотехнологий новых отечественных лекарственных препаратов. Суть его заключалась в том, чтобы помещать молекулу лечебного вещества (как правило, малорастворимого и вследствие этого обладающего плохой биодоступностью) в наноразмерные водорастворимые контейнеры. В качестве последних могли выступать полимеры, мицеллы или любые другие макромолекулы, обладающие внутренним пространством,  куда можно спрятать лекарство. 

 

Был найден целый ряд подобных средств доставки. Одним из них оказалась глицирризиновая кислота. Это вещество добывается из корня солодки, который многие сотни лет применяется в народной медицине России, Китая и других стран. В рамках интеграционного проекта, объединившего лабораторию магнитных явлений ИХКГ СО РАН, Новосибирский институт органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН и Институт химии твёрдого тела и механохимии СО РАН, было показано, что глицирризиновая кислота не только обладает собственной биологической активностью, но и может усиливать действие других препаратов при их совместном применении. Это вещество оказалось способным образовывать супрамолекулярные комплексы (их ещё называют «комплексы включения» или «комплексы гость-хозяин») со множеством препаратов. Лекарства при этом проявляли повышенную эффективность и стабильность. Таким образом удалось снизить их терапевтические дозы в десятки и сотни раз. 

 

Затем встала задача выяснить, каковы механизмы  этого явления: почему так происходит? Как именно комплексы с глицирризиновой кислотой работают в организме? Для начала сотрудница лаборатории магнитных явлений ИХКГ СО РАН Ольга Юрьевна Селютина изучила взаимодействие глицирризиновой кислоты с холестерином. Холестерин, в сознании обывателя выступающий чем-то исключительно вредным и опасным, на самом деле является всего лишь компонентом клеточной мембраны, отвечающим за некоторые её физические свойства. Например, благодаря ему в достаточно широком диапазоне температур клетки остаются целостными. Было установлено, что глицирризиновая кислота с холестерином тоже может образовывать комплексы включения. Стало интересно: способна ли она посредством извлечения холестерина воздействовать на свойства самих мембран? 

 

Для ответа на этот вопрос была исследована эластичность и проницаемость клеточных мембран. «Мы увидели, что в присутствии глицирризиновой кислоты маленькие молекулы, в частности ионы формиата натрия, проходят через клеточную мембрану быстрее, чем в её отсутствие, при этом сама мембрана становится более ”мягкой”», — объясняет Ольга. Затем учёные решили посмотреть, как глицирризиновая кислота влияет на подвижность липидов клеточной мембраны. Последняя представляет собой своеобразный фосфолипидный остов —  двойной слой длинных молекул, обладающих гидрофильной «полярной головой», обращённой наружу, и гидрофобным «хвостом», направленным внутрь клетки.  Исследователи предположили, что влияние глицирризиновой кислоты на пластичность и проницаемость происходит за счёт того, что она может каким-то образом либо извлекать холестерин, либо сама встраиваться в мембрану. Они посмотрели, как в её присутствии изменяется подвижность липидов, и обнаружили, что и «головы», и «хвосты» становятся менее подвижными. Глицирризиновая кислота проникает в наружный полуслой мембраны, и в результате происходит образование неких структур (что-то вроде пор), через которые могут легче проходить ионы.

 

«Тут ещё есть одна интересная особенность: глицирризиновая кислота имеет сродство с клетками печени, соответственно, может служить средством адресной доставки к ним. Она является достаточно дешевым природным соединением, чтобы использоваться в этом плане. Её сейчас активно изучают с точки зрения лечения гепатитов, рака печени и других заболеваний», — рассказывает Ольга Селютина.

 

 

Также исследования показали, что глицирризиновая кислота не только не ускоряет гемолиз эритроцитов, но и делает их более молодыми. Они становятся менее жёсткими и легче проходят через тонкие капилляры, не забивая их.

 

На сегодняшний день новосибирскими учёными  исследован целый ряд комплексов глицирризиновой кислоты с разными лекарствами: средствами от давления, антигельминтными и противовоспалительными препаратами. Показано, что это вещество выступает неким универсальным инструментом, имеющим большие перспективы. «В основном биодоступность определяется двумя факторами: растворимостью в воде и проницаемостью клеточных мембран. Мы показали, что глицирризиновая кислота улучшает оба эти показателя — она образует растворимые комплексы с нерастворимыми лекарствами, плюс воздействует на клеточные мембраны, улучшая их проницаемость», — отмечает Николай Поляков.

 

Помимо лаборатории магнитных явлений в ИХКГ СО РАН в этом направлении работают  исследователи из лаборатории молекулярной динамики и структуры, которые  занимаются моделированием описанных процессов методом молекулярной динамики. В ближайшее время учёные планируют заняться изучением диффузии — процесса прохождения молекулы лекарства через липидный бислой в присутствии глицирризиновой кислоты, а также проникновения самой кислоты внутрь мембраны и перестроек последней.  Эта  характеристика тоже описывает проницаемость, а к тому же выступает дополнительной проверкой уже полученных результатов. 

 

«Разные типы клеток могут по-разному реагировать на воздействие средств доставки. Сейчас совместно с московскими институтами появилась идея применить тот же самый подход для улучшения эффективности средств защиты растений при обработке зерна и листьев, — говорит Николай Поляков. — То есть проблема улучшения проницаемости на самом деле не ограничивается фармакологией. Это может быть и сельское хозяйство, и прочие области. Путей расширения этих исследований очень много, и в каждом случае надо смотреть и типы мембран, и типы клеток».

 

Диана Хомякова

 

Фото: предоставлено спикерами (1), Екатерины Пустоляковой

 

границ | Метаболическая инженерия для производства глицирретиновой кислоты в Saccharomyces cerevisiae

Введение

Солодка относится к бобовым растениям Glycyrrhiza uralensis Fisch., Glycyrrhiza flata Bat. или Glycyrrhiza glabra L., и он широко используется в традиционной фитотерапии (Asl and Hosseinzadeh, 2008). Глицирретиновая кислота (ГК) является одним из основных биоактивных компонентов растений солодки и имеет два оптических изомера, 18 α-ГК и 18 β-ГК (Zhang and Ye, 2009; Li et al., 2014). Между двумя изомерами изомер 18 α-GA присутствует на низких уровнях. 18 β-GA обнаруживается на более высоких уровнях и является основным биологически активным компонентом солодки. 18 β-GA обладает удивительно широким спектром биологической активности, в том числе в качестве противовоспалительного средства (Kowalska and Kalinowska-Lis, 2019), противоопухолевого средства (Wang et al., 2017; Zhou et al., 2019) , иммуномодулирующее средство (Ayeka et al., 2016), гепатопротекторное средство (Mahmoud and Dera, 2015) и другие функциональные медицинские эффекты (Chen et al., 2013; Дин и др., 2020).

В настоящее время ГК в основном получают путем гидролиза глицирризиновой кислоты, которую извлекают из высушенного корня и корневища солодки (Mukhopadhyay and Panja, 2008; Wang C. et al., 2019). Однако дикая солодка была серьезно повреждена и почти исчезла из-за чрезмерной добычи (Shu et al., 2011). Кроме того, качество искусственно выращенной солодки непостоянно, а содержание ГК в натуральной солодке низкое. Сложная структура ГК затрудняет химический синтез ГК (Wang et al., 2018). Спрос на GA увеличился, а цена на GA высока, поэтому изучение других устойчивых источников GA представляет большой интерес.

Введение генов биосинтеза натуральных продуктов в клетки микробного шасси и строительство фабрик микробных клеток для получения высоких уровней целевых натуральных продуктов стали одним из наиболее важных способов производства натуральных продуктов растительного происхождения (Pyne et al., 2019). Развитие синтетической биологии и метаболической инженерии делает возможным микробный биосинтез ГА (Wang C.et al., 2019), а фабрики микробных клеток представляют собой практичный и эффективный способ решения проблемы устойчивого производства медицинских растительных ресурсов (Xu et al., 2020).

Микроорганизмы могут использовать относительно дешевый источник углерода, чтобы сбалансировать рост клеток и синтез натуральных продуктов (Jeandet et al., 2013; Xu et al., 2020). Как правило, микроорганизмы имеют известный генетический фон, и существует множество способов генетических манипуляций с ними, что делает их пригодными для использования в крупномасштабной ферментации (Xu et al., 2020). В настоящее время существует множество натуральных продуктов, таких как артемизинин (Paddon et al., 2013), протопанаксадиол (Dai et al., 2013), гинзенозиды (Yan et al., 2014; Wang et al., 2015; Wei et al., 2015), таншиноны (Guo et al., 2016), масло какао (Wei et al., 2017a; Bergenholm et al., 2018; Wei et al., 2018) и каннабидиоловая кислота (Luo et al. , 2019), которые были успешно синтезированы с использованием метаболически модифицированных Saccharomyces. cerevisiae .

В этом обзоре мы подводим итоги текущего прогресса в производстве GA в S.cerevisiae и открывают некоторые перспективы в этой области.

Химическая структура GA

GA представляет собой тритерпеноид олеананового типа, растворимый в этаноле, метаноле, хлороформе, этилацетате, пиридине и уксусной кислоте, но нерастворимый в воде (Wang et al., 2018; Kowalska and Kalinowska-Lis, 2019). Химическая структура GA сложна, поэтому ее химический синтез затруднен (Wang C. et al., 2019). Гидроксильная группа в положении С-3 и карбоксильная группа в положении С-30 являются основными функциональными группами.В настоящее время химические стратегии в основном используются для модификации ГА (Yang et al., 2020). Было показано, что введение защищенных или незащищенных аминокислот повышает активность GA (Schwarz et al., 2014). Путем этерификации положений C-3 и C-30 в GA могут быть введены различные группы GA и могут быть образованы другие производные, и было показано, что эти производные улучшают активность компонентов, полученных из GA (Maitraie et al., 2009; Шварц и Цук, 2010; Ян и др., 2020). В настоящее время стоимость химического синтеза ГА высока, а выход низок (Wang C.и др., 2019). Кроме того, при химическом синтезе ГА образуется большое количество отходов.

Путь биосинтеза GA

Производство растительного натурального продукта в микроорганизмах требует понимания путей его биосинтеза (Wei et al., 2019). Традиционные стратегии разработки путей обычно осуществляются путем выбора мутантных библиотек, что требует много времени и усилий. С развитием биоинформатики и вычислительной биологии стало возможным определить все потенциальные пути биосинтеза натуральных продуктов у одного вида путем создания многоуровневой технологической платформы omics (Mochida and Shinozaki, 2011).Платформа включает в себя омические анализы данных транскриптов, геномов, протеомов, метаболомов, прогнозирование функции генов и проверку ключевых генов в путях биосинтеза природных продуктов (Nett et al., 2020).

Имеются данные транскриптомного и геномного секвенирования солодки (Li et al., 2010; Ramilowski et al., 2013; Mochida et al., 2017; Gao et al., 2020), которые способствовали лучшему пониманию натуральных продуктов. Пути биосинтеза растений солодки.Был определен путь биосинтеза GA в растениях солодки (Seki et al., 2011). GA принадлежит к группе тритерпеноидов олеананового типа и имеет тот же путь синтеза предшественника, что и другие терпены. И метилэритритолфосфатный (MEP), и мевалонатный (MVA) пути участвуют в синтезе предшественника GA, но GA в основном синтезируется через MVA-путь, который можно разделить на три стадии (рис. 1).

Рисунок 1. Путь биосинтеза глицирретиновой кислоты, разработанный в сконструированном S.cerevisiae . AACT, ацетил-КоА-С-ацетилтрансфераза; HMGS, 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-синтаза; HMGR, 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктаза; МК, мевалонаткиназа; PMK, фосфомевалонаткиназа; MDC, мевалонатдифосфатдекарбоксилаза; GPP, геранилдифосфат; GPPS, геранилдифосфатсинтаза; IDI, изопентенил-пирофосфат-дельта-изомераза; FPP, фарнезилдифосфат; FPPS, фарнезилдифосфатсинтаза; SQS, скваленсинтаза; SQE, скваленэпоксидаза; β-АС, β-амиринсинтаза; CPR, цитохром P450 редуктаза; GuGUAT, Glycyrrhiza uralensis UDP-зависимые глюкуронозилтрансферазы; МВА, мевалоновая кислота; MVAP, мевалонат фосфат; MVAPP, мевалонат дифосфат; IPP, изопентенилпирофосфат; ДМАПП, диметилаллилпирофосфат.

На первом этапе ацетил-КоА катализируется ацетил-КоА-С-ацетилтрансферазой (ААКТ), 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-синтазой (ГМГС) и 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктазой (ГМГР). для получения MVA с последующими многостадийными реакциями для синтеза изопентенилпирофосфата (IPP) и его изомера диметилаллилпирофосфата (DMAPP). HMGR является первым ключевым скорость-лимитирующим ферментом в метаболическом пути MVA, в котором HMGR может катализировать образование MVA из HMG-CoA, что является необратимой реакцией (Friesen and Rodwell, 2004).Было показано, что IPP и DMAPP являются важными промежуточными продуктами этого процесса и предшественниками синтеза терпеноидов в растительных клетках (Wang Q. et al., 2019).

Во-вторых, после катализа геранилдифосфатсинтазы (GPPS), фарнезилдифосфатсинтазы (FPPS), скваленсинтазы (SQS) и скваленэпоксидазы (SQE) IPP используется для синтеза 2,3-оксидосквала. 2,3-оксидосквале является распространенным предшественником для биосинтеза некоторых природных продуктов, таких как стеролы и тритерпены.SQS синтезирует сквален, используя фарнезилдифосфат (FPP) в качестве субстрата, и было установлено, что он является ключевым ферментом, который может направлять поток углерода на биосинтез тритерпена (Seo et al., 2005).

2,3-оксидосквале катализируется β-амиринсинтеазой (bAS) с образованием β-амирина, что является важной стадией реакции в биосинтезе ГА. После этого фермент солодки CYP88D6 катализирует гидроксилирование 11-го положения β-амирина с последующим дальнейшим окислением до 11-оксо-β-амирина (Seki et al., 2008). Солодка CYP72A154 дополнительно катализирует трехэтапную реакцию. Положение C-30 11-оксо-β-амирина сначала гидроксилируется, затем было показано, что продукт окисляется с образованием альдегида, и, наконец, он снова окисляется с образованием карбоксильной группы GA (Seki et al., 2011). Во время этого процесса НАДФН-цитохром Р450 редуктаза (CPR) является основным донором электронов для цитохрома Р450 (CYP450). Электроны переносятся на CYP450, после чего происходит окислительно-восстановительная реакция с субстратом (Zhu et al., 2018). Реакция переноса электрона между CPR и CYP450 является лимитирующей стадией окислительно-восстановительной реакции CYP450, которая влияет на эффективность синтеза GA (Zhu et al., 2018). ГК превращается в глицирризиновую кислоту с помощью UDP-зависимых глюкуронозилтрансфераз GuGT14 и UGT73P12 (Chen et al., 2019; Nomura et al., 2019).

Метаболическая инженерия

S. cerevisiae для производства ГА

S. cerevisiae является одним из наиболее часто используемых модельных шасси, особенно быстро растет на недорогих субстратах, а генетические манипуляции просты.Кроме того, путь MVA в S. cerevisiae может обеспечивать предшественники, такие как IPP и DMAPP, для синтеза терпена. Многие натуральные продукты были успешно синтезированы в S. cerevisiae . После серии генетических модификаций для усиления пути MVA в S. cerevisiae производство артемизинина может достигать 300 мг/л. Дальнейшая оптимизация метаболической сети и условий ферментации повысила титр до 25 г/л (Paddon et al., 2013). Годовой объем производства артемизинина в 100-метровом ферментационном биореакторе 3 составляет 35 тонн, что эквивалентно выходу артемизинина в размере 50 000 му в Artemisia annua , что свидетельствует о том, что клеточные фабрики дрожжей могут производить большое количество натуральных продуктов за короткое время. и с ограниченным пространством.

Путем введения более 20 генов растений, бактерий или грызунов в S. cerevisiae была успешно построена искусственная клеточная фабрика S. cerevisiae , которая может превращать сахара в опиоидные алкалоиды, что представляет собой прорыв в биосинтезе и производстве опиоидные алкалоиды (Galanie et al., 2015). Кроме того, полный микробный синтез основных каннабиноидов и их производных, включая каннабигероловую кислоту (CBGA), тетрагидроканнабиноловую кислоту (THCA) и каннабидиоловую кислоту (CBDA), в S.cerevisiae клеточных фабрик (Luo et al., 2019). Синтез GA требует пути MVA для получения веществ-предшественников. S. cerevisiae можно использовать в качестве подходящей клетки-шасси для снабжения субстратами для синтеза GA, и для продукции GA в S. cerevisiae использовались различные стратегии метаболической инженерии.

β-амирин служит предшественником тритерпеноидов олеананового типа для различных последующих продуктов и увеличивает синтез β-амирина в S.cerevisiae необходим для синтеза GA. Ген AaBAS клонирован из A . annua был введен в S. cerevisiae , что изменило уровень экспрессии гена HMGR и гена ланостеролсинтазы (ERG7), увеличив выработку β-амирина в S. cerevisiae на 50% до 6 мг/л (дополнительная таблица). 1; Кирби и др., 2008). Этот результат показывает, что тритерпены могут продуцироваться в S. cerevisiae , а гетерологичный ген из другого растения может увеличивать продукцию β-амирина.Впоследствии Дай и соавт. (2015) интегрировали два разных гена bAS , полученных из Glycyrrhiza glabra и Panax ginseng , и еще одну копию генов SQS и SQE нативных дрожжей в дрожжах. После инкубации в среде YPD с 2% глюкозой в течение 7 дней анализ газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ/МС) показал, что выход продукции β-амирина составил 107 мг/л с выходом 9,3 мг/г массы сухих клеток (DCW). ) (Дополнительная таблица 1; Dai et al., 2015). Эти исследования показали, что избыточная экспрессия ключевых генов в пути биосинтеза ГА может увеличивать продукцию предшественников.

Комбинация пошагового рационального рефакторинга и стратегий направленной регуляции потока может улучшить продукцию β-амирина. Введение гена bAS из Glycyrrhiza glabra и гетерологичных генов скваленмонооксигеназы из Candida albicans в S. cerevisiae в сочетании с повышенной экспрессией изопентенилпирофосфатизомеразы (IPI), генов FPPS и SQS UPC2 является глобальным транскрипционным фактором, регулирующим синтез стеролов у S.cerevisiae и модификации сайта связывания UPC2, направленного метаболического потока для биосинтеза β-амирина. После серии генетических модификаций и подходящей периодической ферментации с подпиткой этанолом конечный титр β-амирина в штаммах S. cerevisiae достиг 138,80 мг/л (Zhang et al., 2015). Это говорит о том, что оптимизация пути и рефакторинг потока могут улучшить синтез натуральных продуктов в искусственных дрожжах. Лю и др. ввел оптимальный путь ацетил-КоА и удалил конкурирующий путь ацетил-КоА в S.cerevisiae , уравновешивая различные факторы, которые значительно снижают потребление энергии и использование глюкозы. Было обнаружено, что конечная продукция β-амирина составляет 279,0 ± 13,0 мг/л, что является самым высоким уровнем производства β-амирина, о котором когда-либо сообщалось (дополнительная таблица 1; Liu et al., 2019). Это исследование показало, что глобальный анализ между поставкой предшественников и образованием продукта, а не анализ одного ключевого гена, может эффективно улучшить биосинтез натуральных продуктов в сконструированных микроорганизмах. В пути биосинтеза ГА β-амирин дополнительно катализируется CYP88D6 и CYP72A154 для синтеза ГА (дополнительная таблица 1; Seki et al., 2008, 2011).

Секи и др. (2011) также подтвердили ключевую роль генов CYP450 в пути биосинтеза GA путем введения bAS, CYP88DE, CYP72A154 и CPR в дикий тип S. cerevisiae , тем самым перенаправляя метаболический поток на синтез GA. В конечном итоге это привело к уровню продукции 11-оксо-β-амирина, равному 76 мкг/л, и количеству продукции GA, равному 15 мкг/л (дополнительная таблица 1; Seki et al., 2011). Эти результаты указывают на возможность синтеза ГА в дрожжах с использованием синтетической биологии.Улучшить выработку ГА можно, улучшив каталитическую стадию, на которой CYP72A154 превращает 11-оксо-β-амирин в ГА. Чжу и др. дополнительно сбалансировали системы окисления и восстановления путем введения двух новых генов CYP450, Uni25647 и CYP72A63, и спаривания новых редуктаз цитохрома P450 GuCPR1 из Glycyrrhiza uralensis . Благодаря оптимизированным модулям окисления и восстановления, а также расширенной периодической ферментации с подпиткой синтез 11-оксо-β-амирина и GA достиг 108,1 ± 4,6 мг/л и 18.9 ± 2,0 мг/л соответственно (Zhu et al., 2018). Это самые высокие титры, когда-либо зарегистрированные для GA и 11-оксо-β-амирина, синтезированного из S. cerevisiae . Эта работа также показала, что окислительно-восстановительный баланс, опосредованный генами CYP450 и CPR, важен для синтеза GA. Ван и др. направил восходящий поток углерода от ацетил-КоА к 2,3-оксидосквалену путем введения недавно открытого гена цитохрома b5 из Glycyrrhiza uralensis (GuCYB5) и сверхэкспрессии 10 известных генов пути MVA ( ERG20 , ERG9 , ERG1 , THMG1 , ERG10 , ERG10 , ERG8 , ERG13 , ERG12 , ERG19 , IDI1 ) S.cerevisiae . Титр 11-оксо-β-амирина и GA во встряхиваемой колбе увеличился до 80 и 8,78 мг/л соответственно (дополнительная таблица 1; Wang C. et al., 2019).

Многочисленные исследования недавно показали возможность синтеза GA в S. cerevisiae (Zhu et al., 2018; Wang C. et al., 2019). Согласно опубликованным результатам, микробный синтез ГА и других натуральных продуктов может быть достигнут с помощью нескольких ключевых процедур (рис. 2). Во-первых, идентифицируются растения, содержащие GA или другие биологически активные компоненты растений.Во-вторых, анализы транскриптомики, геномики, протеомики и метаболомики используются для восстановления путей и ключевых ферментов, связанных с синтезом ГА или других природных продуктов (Chen et al., 2020; Gao et al., 2020; Nett et al., 2020; Шринивасан и Смольке, 2020 г.). После этого выбираются соответствующие клетки шасси, которые обеспечивают предшественники для синтеза натуральных продуктов, для создания и оптимизации связанных фабрик микробных клеток. Некоторые инструменты синтетической биологии, такие как технология CRISPR-Cas9, могут эффективно ввести путь биосинтеза GA или других натуральных продуктов в клетки шасси.Эти базовые клетки затем можно использовать в качестве фабрик микробных клеток. Искусственно созданные клеточные фабрики необходимо постоянно оптимизировать в рамках цикла «проектирование-сборка-тестирование-обучение» (DBTL) (Nielsen and Keasling, 2016). Цикл DBTL включает в себя открытие новых ферментов, экспрессию гетерологичных генов, разработку промоторов, баланс метаболических потоков, оптимизацию путей, баланс системы окисления и восстановления, метаболические модели в масштабе генома и другие стратегии метаболической инженерии (Jiang et al., 2020; Ko et al., 2020; Тан и др., 2020 г.; Ван М. и др., 2020). Наконец, можно получить высокопродуктивную ГА или другую фабрику микробных клеток из натуральных продуктов. Поскольку ГК нерастворима в воде, стратегии, использующие метаболизм липидов или метаболизм других суборганелл, могут привести к высокопроизводительному производству ГК (Cao et al., 2020; Ma et al., 2019). Помимо S. cerevisiae , другие дрожжи также могут быть оптимизированы для биосинтеза натуральных продуктов в будущем (Wei et al., 2017b; Wang J. et al., 2020).

Рисунок 2. Проектирование заводов микробных клеток для синтеза глицирретиновой кислоты или других натуральных растительных продуктов. (A) Активные компоненты идентифицированы в традиционных китайских травах или других растениях-кандидатах. (B) Свежие образцы собираются, и мультиомные технологии используются для обнаружения путей биосинтеза натуральных продуктов. (C) Цикл Design-Build-Test-Learn используется для создания и оптимизации фабрик микробных клеток для биосинтеза натуральных продуктов. (D) Разделение и очистка целевых натуральных продуктов.

Заключение и перспективы на будущее

GA широко используется в клинической практике, но поставки GA ограничены из-за традиционных методов посева. Инструменты метаболической инженерии и синтетической биологии обеспечивают возможные стратегии эффективного производства GA в S. cerevisiae . Успешное производство амирина с высоким содержанием β-амирина и ГА с использованием сконструированного штамма S. cerevisiae показывает, что дрожжи являются подходящей микробной средой для производства ГА.DBTL и другие инженерные стратегии еще больше увеличат производство GA, возможно, обеспечив стабильную поставку GA. В будущем другие натуральные продукты, полученные из традиционных китайских трав или других растений, также могут быть синтезированы с использованием модифицированного S. cerevisiae .

Вклад авторов

YW и RG задумали это исследование. YW, RG, MW и ZG написали рукопись. WL, C-YJ и X-JJ пересмотрели рукопись. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№ 31800079) и Проектом по продвижению молодых талантов в провинции Хэнань (2020HYTP038).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить TopEdit (www.topeditsci.com) за редактирование этой рукописи на английском языке.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2020.588255/full#supplementary-material

.

Ссылки

Айека, П. А., Биан, Ю., Мвитари, П. Г., Чу, X., Чжан, Ю., Узайисенга, Р., и соавт. (2016). Иммуномодулирующий и противораковый потенциал Gan cao ( Glycyrrhiza uralensis Fisch.) полисахаридов за счет ингибирования роста клеток карциномы толстой кишки CT-26 и усиления цитокина IL-7 in vitro. BMC Дополнение Альтернативный вариант. Мед. 16:206. doi: 10.1186/s12906-016-1171-4

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бергенхольм Д., Госсинг М., Вей Ю. Дж., Сиверс В. и Нильсен Дж. (2018). Модуляция насыщенности и длины цепи жирных кислот в Saccharomyces cerevisiae для производства липидов, подобных какао-маслу. Биотехнология.биоинж. 115, 932–942. дои: 10.1002/бит.26518

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Цао, X., Ян, С., Цао, К., и Чжоу, Ю. Дж. (2020). Использование метаболизма суборганелл для биосинтеза изопреноидов в дрожжах. Синтез. Сист. Биотехнолог. 5, 179–186. doi: 10.1016/j.synbio.2020.06.005

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Chen, K., Hu, Z.-M., Song, W., Wang, Z.-L., He, J.-B., Shi, X.-M., et al. (2019). Разнообразие O -гликозилтрансфераз способствует биосинтезу флавоноидных и тритерпеноидных гликозидов в Glycyrrhiza uralensis . Синтезатор ACS. Биол . 8, 1858–1866 гг. doi: 10.1021/acssynbio.9b00171

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чен Р., Ян С., Чжан Л. и Чжоу Ю. Дж. (2020). Передовые стратегии производства натуральных продуктов на дрожжах. iScience 23:100879. doi: 10.1016/j.isci.2020.100879

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Чен С., Цзоу Л., Ли Л. и Ву Т. (2013). Защитный эффект глицирретиновой кислоты на хронический фиброз печени, вызванный четыреххлористым углеродом, у мышей посредством активации Nrf2. PLoS One 8:e53662. doi: 10.1371/journal.pone.0053662

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Dai, Z., Liu, Y., Zhang, X., Shi, M., Wang, B., Wang, D., et al. (2013). Метаболическая инженерия Saccharomyces cerevisiae для производства гинзенозидов. Метаб. англ. 20, 146–156. doi: 10.1016/j.ymben.2013.10.004

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Дай З., Ван Б., Лю Ю., Shi, M., Wang, D., Zhang, X., et al. (2015). Получение агликонов гинзенозидов в пекарских дрожжах. науч. Респ. 4, 3698–3698.

Академия Google

Дин Х., Дэн В., Дин Л., Е X., Инь С. и Хуанг В. (2020). Глицирретиновая кислота и ее производные как потенциальное альтернативное лекарство для облегчения симптомов у пациентов, не госпитализированных с COVID-19. J. Med. Вирол. 92, 2200–2204. doi: 10.1002/jmv.26064

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Фризен, Дж.А. и Родвелл В.В. (2004). 3-гидрокси-3-метилглутарилкоэнзим-А (ГМГ-КоА) редуктазы. Геном Биол. 5, 248–248.

Академия Google

Галани, С., Тодей, К., Тренчард, И. Дж., Филсингер Интерранте, М., и Смольке, К. Д. (2015). Полный биосинтез опиоидов в дрожжах. Наука 349, 1095–1100. doi: 10.1126/science.aac9373

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гао, З., Тянь, С., Хоу, Дж., Чжан, З., Yang, L., Hu, T., et al. (2020). Анализ транскриптома на основе RNA-Seq раскрывает молекулярный механизм биосинтеза тритерпеноидов в Glycyrrhiza glabra . Биоорг. Мед. Химия. лат. 30:127102. doi: 10.1016/j.bmcl.2020.127102

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Guo, J., Ma, X., Cai, Y., Ma, Y., Zhan, Z., Zhou, Y.J., et al. (2016). Неразборчивость цитохрома P450 приводит к раздвоению пути биосинтеза таншинонов. Новый Фитол. 210, 525–534.doi: 10.1111/nph.13790

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Жанде П., Вассеро Ю., Частанг Т. и Куро Э. (2013). Инженерные микробные клетки для биосинтеза природных соединений фармацевтического назначения. Биомед. Рез. Междунар. 2013:780145.

Академия Google

Цзян Т., Ли К., Тэн Ю., Чжан Р. и Ян Ю. (2020). Последние достижения в повышении метаболической устойчивости микробных клеточных фабрик. Курс. мнение Биотехнолог. 66, 69–77. doi: 10.1016/j.copbio.2020.06.006

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кирби, Дж., Романини, Д.В., Парадайз, Э.М., и Кислинг, Дж.Д. (2008). Инженерное производство тритерпена в Saccharomyces cerevisiae –β-амиринсинтаза из Artemisia annua. он FEBS J. 275, 1852–1859. doi: 10.1111/j.1742-4658.2008.06343.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ко, Ю.-S., Kim, J.W., Lee, J.A., Han, T., Kim, G.B., Park, J.E., et al. (2020). Инструменты и стратегии системной метаболической инженерии для разработки фабрик микробных клеток для химического производства. Хим. соц. Ред. 49, 4615–4636. дои: 10.1039/d0cs00155d

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ковальска, А., и Калиновска-Лис, У. (2019). 18бета-глицирретиновая кислота: ее основные биологические свойства и применение в дерматологии. Междунар.Дж. Космет Наука. 41, 325–331.

Академия Google

Ли, Дж. Ю., Цао, Х. Ю., Лю, П., Ченг, Г. Х., и Сунь, М. Ю. (2014). Глицирризиновая кислота в лечении заболеваний печени: обзор литературы. Биомед. Рез. Междунар. 2014:872139.

Академия Google

Li, Y., Luo, H.-M., Sun, C., Song, J.-Y., Sun, Y.-Z., Wu, Q., et al. (2010). Анализ EST выявляет предполагаемые гены, участвующие в биосинтезе глицирризина. BMC Genomics 11:268. дои: 10.1186/1471-2164-11-268

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лю, Х., Фан, Дж., Ван, К., Ли, К., и Чжоу, X. (2019). Усиленный синтез β-амирина в Saccharomyces cerevisiae за счет соединения оптимального пути поступления ацетил-КоА. Дж. Сельское хозяйство. Пищевая хим. 67, 3723–3732. doi: 10.1021/acs.jafc.9b00653

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Луо, X., Рейтер, М. А., Деспо, Л., Вонг, Дж., Денби, К.М., Лехнер А. и др. (2019). Полный биосинтез каннабиноидов и их ненатуральных аналогов в дрожжах. Природа 567, 123–126. doi: 10.1038/s41586-019-0978-9

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ма, Т., Ши, Б., Йе, З., Ли, X., Лю, М., Чен, Ю., и др. (2019). Липидная инженерия в сочетании с систематической метаболической инженерией Saccharomyces cerevisiae для высокопроизводительного производства ликопина. Метаб. англ. 52, 134–142.doi: 10.1016/j.ymben.2018.11.009

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Махмуд, А.М., и Дера, Х.С.А. (2015). 18β-Глицирретиновая кислота оказывает защитное действие против вызванной циклофосфамидом гепатотоксичности: потенциальная роль активации PPARγ и Nrf2. Гены Нутр. 10:41.

Академия Google

Maitraie, D., Hung, C., Tu, H., Liou, Y., Wei, B., Yang, S., et al. (2009). Синтез, противовоспалительная и антиоксидантная активность производных 18β-глицирретиновой кислоты как химических медиаторов и ингибиторов ксантиноксидазы. Биоорг. Мед. хим. 17, 2785–2792. doi: 10.1016/j.bmc.2009.02.025

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мочида К., Сакураи Т., Секи Х., Йошида Т., Такахаги К., Савай С. и др. (2017). Проект сборки генома и аннотация Glycyrrhiza uralensis , лекарственного бобового растения. Завод Ж. 89, 181–194. doi: 10.1111/tpj.13385

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мочида, К.и Шинозаки, К. (2011). Достижения в области инструментов омики и биоинформатики для системного анализа функций растений. Физиол клеток растений. 52, 2017–2038. doi: 10.1093/pcp/pcr153

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мухопадхьяй, М., и Панджа, П. (2008). Новый процесс извлечения натурального подсластителя из корней солодки ( Glycyrrhiza glabra ). Сентябрь Очист. Технол. 63, 539–545. doi: 10.1016/j.seppur.2008.06.013

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Номура, Ю., Seki, H., Suzuki, T., Ohyama, K., Mizutani, M., Kaku, T., et al. (2019). Функциональная специализация UDP-гликозилтрансферазы 73P12 в солодке с образованием сладкого тритерпеноидного сапонина, глицирризина. Завод J. 99, 1127–1143. doi: 10.1111/tpj.14409

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Paddon, C.J., Westfall, P.J., Petera, D.J., Benjamin, K.R., Fisher, K., Mcphee, D.J., et al. (2013). Высокоуровневое полусинтетическое производство сильнодействующего противомалярийного артемизинина. Природа 496, 528–532.

Академия Google

Рамиловски Дж. А., Савай С., Секи Х., Мочида К., Йошида Т., Сакураи Т. и др. (2013). Glycyrrhiza uralensis ландшафт транскриптома и изучение фитохимических веществ. Физиол клеток растений. 54, 697–710. doi: 10.1093/pcp/pct057

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шварц С., Лукас С. Д., Зоммерверк С. и Цук Р. (2014). Аминопроизводные глицирретиновой кислоты как потенциальные ингибиторы холинэстераз. Биоорг. Мед. хим. 22, 3370–3378. doi: 10.1016/j.bmc.2014.04.046

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Секи Х., Охяма К., Савай С., Мизутани М., Ониши Т., Судо Х. и др. (2008). β-амирин-11-оксидаза солодки, цитохром P450, играющий ключевую роль в биосинтезе тритерпенового подсластителя глицирризина. Проц. Натл. акад. науч. США 105, 14204–14209. doi: 10.1073/pnas.0803876105

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Секи, Х., Sawai, S., Ohyama, K., Mizutani, M., Ohnishi, T., Sudo, H., et al. (2011). Тритерпеновая функциональная геномика солодки для идентификации CYP72A154, участвующего в биосинтезе глицирризина. Растительная клетка 23, 4112–4123. doi: 10.1105/tpc.110.082685

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сео, Дж., Чон, Дж., Шин, К., Ло, С., Хан, С., Ю, К. и др. (2005). Сверхэкспрессия скваленсинтазы у элеутерококка колючего увеличивает накопление фитостерола и тритерпена. Фитохимия 66, 869–877. doi: 10.1016/j.phytochem.2005.02.016

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шу, С., Чен, Ю., и Канг, X. (2011). «Положение ресурсов дикой солодки в Китае, причины и меры противодействия», Международная конференция по дистанционному зондированию (окружающая среда) и транспортной инженерии , Нанкин, 2715–2718.

Академия Google

Сринивасан, П., и Смольке, К.Д. (2020). Биосинтез лекарственных тропановых алкалоидов в дрожжах. Природа 585, 614–619.

Академия Google

Tang, H., Wu, Y., Deng, J., Chen, N., Zheng, Z., Wei, Y., et al. (2020). Архитектура промотора и разработка промотора в Saccharomyces cerevisiae . Метаболиты 10:320. doi: 10.3390/metabo10080320

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван, К., Цай, Х., Чжао, Х., Ян, Ю., Ши, Дж., Чен, С., и другие. (2018). Закономерности распределения метаболитов в лекарственных частях дикорастущей и культурной солодки. Дж. Фарм. Биомед. Анальный. 161, 464–473. doi: 10.1016/j.jpba.2018.09.004

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван, К., Су, X., Сунь, М., Чжан, М., Ву, Дж., Син, Дж., и др. (2019). Эффективное производство глицирретиновой кислоты в метаболически сконструированных Saccharomyces cerevisiae с помощью интегрированной стратегии. Микроб. Сотовый факт. 18:95.

Академия Google

Ван, К., Цюань, С., и Сяо, Х. (2019).На пути к эффективному биосинтезу терпеноидов: управление запасами IPP и DMAPP. Биоресурс. Биопроцесс. 6:6.

Академия Google

Ван Дж., Ледесма-Амаро Р., Вей Ю., Джи Б. и Джи X.-Дж. (2020). Метаболическая инженерия для увеличения накопления липидов в Yarrowia lipolytica – обзор. Биоресурс. Технол. 313:123707. doi: 10.1016/j.biortech.2020.123707

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван, М., Вэй, Ю., Джи, Б., и Нильсен, Дж. (2020). Достижения в области метаболической инженерии Saccharomyces cerevisiae для производства эквивалента какао-масла. Фронт. биоинж. Биотехнолог. 8:594081. doi: 10.3389/fbioe.2020.594081

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ван, П., Вэй, Ю., Фан, Ю., Лю, К., Вэй, В., Ян, К., и другие. (2015). Производство биоактивных гинсенозидов Rh3 и Rg3 метаболически модифицированными дрожжами. Метаб. англ. 29, 97–105. doi: 10.1016/j.ymben.2015.03.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван С., Шен Ю., Цю Р., Чен З., Чен З. и Чен В. (2017). 18 β-глицирретиновая кислота проявляет сильное противоопухолевое действие в отношении колоректального рака за счет ингибирования пролиферации и миграции клеток. Междунар. Дж. Онкол. 51, 615–624. doi: 10.3892/ijo.2017.4059

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вэй, В., Ван, П., Вэй, Ю., Лю, К., Ян, К., Чжао Г. и др. (2015). Характеристика UDP-гликозилтрансфераз женьшеня Panax, катализирующих протопанаксатриол и биосинтез биоактивных гинсенозидов F1 и Rh2 в метаболически сконструированных дрожжах. мол. Завод 8, 1412–1424. doi: 10.1016/j.molp.2015.05.010

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вей Ю., Бергенхольм Д., Госсинг М., Сиверс В. и Нильсен Дж. (2018). Экспрессия генов какао в Saccharomyces cerevisiae улучшает производство какао-масла. Микроб. Клеточный фактор. 17:11.

Академия Google

Вей Ю., Госсинг М., Бергенхольм Д., Сиверс В. и Нильсен Дж. (2017a). Увеличение производства липидов, подобных какао-маслу, Saccharomyces cerevisiae за счет экспрессии выбранных генов какао. АМБ Экспресс 7:34.

Академия Google

Вей, Ю., Сиверс, В., и Нильсен, Дж. (2017b). Способность жироподобных липидов какао-масла немасляных и масличных дрожжей в условиях культивирования с ограниченным содержанием азота. Заяв. микробиол. Биотехнолог. 101, 3577–3585. doi: 10.1007/s00253-017-8126-7

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вэй, Ю., Джи, Б., Сиверс, В., Сюй, Д., Халкиер, Б. А., и Нильсен, Дж. (2019). Идентификация генов, участвующих в биосинтезе масла ши из плодов Vitellaria paradoxa, посредством транскриптомики и функциональной гетерологичной экспрессии. Заяв. микробиол. Биотехнолог. 103, 3727–3736. doi: 10.1007/s00253-019-09720-3

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сюй, X., Лю Ю., Ду Г., Ледесма-Амаро Р. и Лю Л. (2020). Разработка микробного шасси для биосинтеза натуральных продуктов. Тенденции биотехнологии. 38, 779–796. doi: 10.1016/j.tibtech.2020.01.002

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Yan X., Fan Y., Wei W., Wang P., Liu Q., Wei Y., et al. (2014). Производство биоактивного соединения гинзенозида К в метаболически модифицированных дрожжах. Сотовые Res. 24, 770–773. doi: 10.1038/cr.2014.28

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ян, Ю., Zhu, Q., Zhong, Y., Cui, X., Jiang, Z., Wu, P., et al. (2020). Синтез, антимикробная и противовоспалительная активность производных 18β-глицирретиновой кислоты. Биоорг. хим. 101:103985. doi: 10.1016/j.bioorg.2020.103985

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан Г., Цао К., Лю Дж., Лю Б., Ли Дж. и Ли К. (2015). Рефакторинг синтеза β-амирина в Saccharomyces cerevisiae . Айше Дж. 61, 3172–3179. дои: 10.1002/aic.14950

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Чжоу Ф., Ву Г., Цай Д., Сюй Б., Ян М., Ма Т. и др. (2019). Синтез и биологическая активность производных глицирретиновой кислоты как противоопухолевых средств. евро. Дж. Мед. хим. 178, 623–635.

Академия Google

Чжу, М., Ван, К., Сунь, В., Чжоу, А., Ван, Ю., Чжан, Г., и др. (2018). Повышение синтеза 11-оксо-β-амирина и глицирретиновой кислоты в Saccharomyces cerevisiae за счет сочетания новой системы окисления и восстановления из бобовых растений. Метаб. англ. 45, 43–50. doi: 10.1016/j.ymben.2017.11.009

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Эффективное производство глицирретиновой кислоты в метаболически модифицированных Saccharomyces cerevisiae с помощью комплексной стратегии | Microbial Cell Factories

Предсказание и клонирование CYB5

G. uralensis

Используя последовательность белка CYB5 ( AtCYB5 ) из Arabidopsis thaliana в качестве эталона, мы смогли идентифицировать последовательность CYB5 из G.uralensis с использованием веб-сайта http://ngs-data-archive.psc.riken.jp/Gur/blast.pl (по состоянию на 30 марта 2017 г.). Для клонирования GuCYB5, мы использовали праймеры, найденные в дополнительном файле 1: таблица S1.

Конструирование вектора

Тотальную РНК выделяли из свежих корней G. uralensis с использованием набора RNA prep pure Plant Kit (TIANGEN, Пекин, Китай). Мы получили кДНК G. uralensis с использованием набора для синтеза кДНК Prime-Script 1st Strand (Takara, Далянь, Китай).Для амплификации β AS , CYPDD6 и CYP72A154 из кДНК G. uralensis мы использовали праймеры из дополнительного файла 1: Таблица S1. Для улучшения экспрессии гена в S. Cerevisiae мы оптимизировали кодоны CYP88D6 (OP- CYP88D6 ) и CYP72A154 (OP- CYP72A154 ) для генов, клонирующих в PUC57, которые были синтезированы Genscript (Genscript, Nanjing , Китай). Их оптимизированные последовательности показаны в дополнительном файле 1.

Мы сконструировали pUC19L-Ptdh4-Tcyc1, pUC19L-Ppgk1-Tadh2, pUC19L-Ptef1-Tpgk1 и pUC19L-Ptef2-Tcyc1, используя бесшовное клонирование и сборку, внедрив комплект pEASY-UniSeamless для клонирования и сборки (TransGen Biotech, Пекин, Китай). ) (Дополнительный файл 1: рис. S9a). Промоторы TDh4, PGK1, TEF1 и TEF2, а также терминаторы CYC1, PGK1 и ADh2 амплифицировали из геномной ДНК S. cerevisiae Cen.pk2-1D с праймерами, показанными в дополнительном файле 1: Таблица С1.Праймеры, используемые для бесшовного клонирования и сборки, можно увидеть в дополнительном файле 1: таблица S2.

Рабочий процесс для строительства и бесшовные клонирование для следующего: PTEF2- ERG19 -CYC1, PTDH4- CYP88D6 -TCYC1, PTDH4-OP- CYP88D6 -TCYC1, PPGK1- β AS -TADH2 , PPGK1- THMG1 -TADH2, PTDH4- ERG20 + 9 -TCYC1, PTDH4-ERG 9 + 20 -TCYC1, PTEF1- ERG1 -TPGK1 и PTDH4- ATCPR1 -TCYC1 (Дополнительный файл 1: рис.С9б). Праймеры, используемые для бесшовного клонирования и сборки, показаны в дополнительном файле 1: Таблица S3.

Чтобы построить кассеты экспрессии для PDTTH4- ERG8 -TTH4 и PTDH4- ERG12 -TTH4- ERG12 -TTTH4, ERG8 и генов ERG12 были усилены из генома ДНК S. Cerevisiae CEN.PK2-1D расщеплены Sal I и Not I. После расщепления их лигировали в Sal I и Not I, расщепленные pATP424 ДНК-лигазой Т4 (Takara, Далянь, Китай).Мы использовали кДНК G. uralensis для амплификации GuCYB5 и лигирования ее в pATP424, так же, как ERG8 , с образованием плазмиды pATP424- GuCYB5 .

Кассеты экспрессии генов PADH2- ERG10 -TADH2, PADH2- CYP72A154 -TADH2, PADH2-OP- CYP72A154 -TADH2 и PPGK1- IDI1 -TPGK1 были построены аналогичным образом, за исключением того, что ферментативное пищеварение произошло с AVR II и Fse I вместо Sal I и Not I.Праймеры, использованные для обнаружения конструкции плазмиды в дополнительном файле 1: таблица S4, и все плазмиды, использованные в исследовании, показаны в таблице 1.

Таблица 1 Плазмиды, использованные в этом исследовании

Конструкция штамма

Saccharomyces cerevisiae Cen.pk2-1D, который использовали в качестве исходного штамма, был приобретен у EUROSCARF. Для трансформации штаммов S. cerevisiae использовали стандартный метод ацетата лития или метод электропорации. Генные кассеты PPGK1- β как -TADH, P TDH4- CYP88D6 -TCYC1, PADH2- CYP72A154 -TADH2 и PTDH4- ATCPR1 -TCYC1 были усилены из соответствующих плазмид.Последовательности rDNA-up и rDNA-down амплифицировали из ДНК S. cerevisiae Cen.pk2-1D с использованием набора праймеров GA-rDNA-up-F&R и GA-rDNA-down-F&R. Для амплификации последовательности маркера Leu2 из pRS425 использовали набор праймеров GA-Leu2-F&R. Эти шесть амплифицированных фрагментов ДНК были электропорированы в S. cerevisiae Cen.pk2-1D с использованием метода сборки ДНК, описанного в предыдущих исследованиях [15], с последующим отбором на чашке SD-Leu. Точно так же, фрагменты PPGK1- β как -TADH, PTDH4-OP- CYP88D6 -TCYC1, PADH2-OP- CYP72A154 -TADH2, PTDH4- ATCPR1 -TCYC1, RDNA-UP и RDNA- down были амплифицированы и переведены в S.cerevisiae Цен.pk2-1D. Мы случайным образом отобрали колонии из чашек с SD-Leu, после чего были подтверждены шесть положительных результатов. Штамм с самым высоким уровнем продукции GA был разработан как штамм Y1. Штамм

Y2 был сконструирован путем интеграции ERG20 + 9 (слитый ген ERG20 и ERG9 способом ERG20+ERG9), tHMG1, и ERG1 в дельта-сайты Y1. Кассеты генной экспрессии Ptdh4- ERG20 + 9 -Tcyc1, Ppgk1- tHMG1 -Tadh2 и Ptef1- ERG1 -Tpgk1 амплифицировали из соответствующих им плазмид.Delta-up и Delta-down амплифицировали из ДНК S. cerevisiae Cen.pk2-1D с использованием набора праймеров Delta-up-F&R и Delta-down-F&R. Мы амплифицировали маркер Ura3 из pRS426, используя набор праймеров delta-URA-F&R. После переноса этих пяти фрагментов в штамм Y1 мы отобрали пять положительных колоний с штаммом, продуцирующим наибольшее количество GA, сконструированным как штамм Y2. Конструкция штамма Y3 была аналогична штамму Y2, за исключением того, что вместо ERG20 + 9 использовали ERG9 + 20 (слитый ген ERG20 и ERG9 способом ERG9+ERG20).

Интегрируя ERG10 , ERG8 и ERG13 в сайт YDR007W штамма Y1, мы создали штамм Y4. Мы амплифицировали кассеты экспрессии генов ERG10 , ERG8 и ERG13 из плазмид pATP406- ERG10 , pATP406- ERG8 и pATP4005 060. Последовательности trp-up и trp-down амплифицировали из ДНК S. cerevisiae Cen.pk2-1D с использованием набора праймеров Trp-up-F&R и Trp-down-F&R.Маркер His амплифицировали из pRS423 с использованием набора праймеров Trp-his-F&R. Мы электропорировали эти пять фрагментов в краситель Y1 и выбрали положительную колонию из планшета SD-His, которую мы сконструировали как штамм Y4. Штамм

Y5 был сконструирован путем вставки ERG12 , ERG8 , ERG19 и IDI1 в сайт YPL069C, который представлял собой область кодирования гена BTS1 . Гены экспрессионные кассеты ERG12 , ERG19 , ERG19, , IDI1 и IDI1 были усилены из плазмиды PATP406- ERG12 , PATP406- ERG8 , PUC19L-P TEF2 ERG19 -T cyc1 и pATP406- IDI1 с использованием набора праймеров BTS1-E12-F&R, BTS1-E8-F&R, BTS1-E19-F&R и BTS1-IDI1-F&R.Мы амплифицировали последовательности BTS1-up и BTS1-down из ДНК S. cerevisiae Cen.pk2-1D с использованием набора праймеров BTS1-up-F&R и BTS1-down-F&R. Мы использовали набор праймеров BTS1-Trp-F&R для амплификации маркера Trp из pATP424. Эти шесть фрагментов были перенесены в штамм Y1 после отбора из чашек SD-Trp. Штамм

Y6 был сконструирован путем интеграции ERG20 + 9 (слитые гены ERG20 и ERG9 способом ERG9+ERG20), tHMG1, и ERG1 в дельта-сайты Y4.Полученные фрагменты были той же деформации, что и в конструкции Y2. Положительные колонии отбирали из чашек SD-leu-his-ura и подтверждали с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования.

Штамм Y7 был сконструирован путем интеграции генных кассет ERG12 , GuCYB5 , ERG19, и IDI1 в сайт YPL069C штамма Y6. Кассету генной экспрессии GuCYB5 амплифицировали из pATP406- GuCYB5 с использованием набора праймеров BTS1-Cyb5-F и BTS1-Cyb5-R.Другие фрагменты были получены, как указано в конструкции штамма Y5.

Геномную организацию этих штаммов можно увидеть в дополнительном файле 1: рис. S10. Праймеры, использованные для интеграции, показаны в дополнительном файле 1: таблица S5, а все использованные штаммы показаны в таблице 2.

Таблица 2 Штаммы, использованные в этом исследовании

Выращивание дрожжей и среда

Для отбора положительных колоний во время инженерии мы использовали среду для отсева SD, дополненную соответствующим порошком для отсева (SD-His-Leu-Trp-Ura).Все штаммы сначала предварительно культивировали в культуральных пробирках объемом 15 мл, содержащих 2 мл среды, и выращивали при 30 °C, 250 об/мин и OD 600 , равной примерно 1,0. Затем колбы (50 мл), содержащие 15 мл среды, инокулировали этими посевными культурами до OD 600 , равной 0,05. При периодической ферментации штаммы (Cen.pK2-1D, Y1–Y7) выращивали в среде YPD (дрожжевой экстракт 20 г/л, триптон 10 г/л и глюкоза 20 г/л) при 30 °C при 250 об/мин в течение 6 дней в колбе. После 144 ч культивирования измеряли плотность клеток и концентрацию метаболитов во всех образцах.Результаты ферментации в колбах представлены как среднее значение  ± S.D. не менее трех независимых экспериментов.

Ферментационная среда состояла из глюкозы (19,5 г/л), (Nh5) 2 SO 4 (15 г/л), KH 2 PO4 (8 г/л), MgSO 4 · 7H 2 O (6,15 г/л), раствор витамина (12 мл/л) и раствор микроэлемента (10 мл/л). Раствор микроэлементов содержал: ZnSO 4 · 7H 2 O (5,75 г/л), MnCl 2 · 4H 2 O (0,75 г/л),32 г/л), безводный CuSO 4 (0,32 г/л), CoCl 2 ·6H 2 O (0,47 г/л), Na 2 MoO 4 ·2H 2 2 2 2 O (0,47 г/л) 0,48 г/л), CaCl 2 ·2H 2 O (2,9 г/л), FeSO 4 ·7H 2 O (2,8 г/л), 0,5 М ЭДТА (80 мл/л). Витаминный раствор содержал: биотин (0,05 г/л), пантотенат кальция (1 г/л), никотиновую кислоту (1 г/л), мио-инозитол (25 г/л), тиамина HCl (1 г/л), пиридоксаль HCl (1 г/л) и p -аминобензойная кислота (0.2 г/л). В качестве среды для ферментации использовали среды, описанные ранее [15, 17].

Штамм Y7 использовали для производства GA посредством периодической ферментации с подпиткой. Посевную культуру готовили путем инокуляции нескольких колоний в колбу на 250 мл, содержащую 50 мл культуральной среды, и инкубации при 30°C при 250 об/мин в течение 24 часов. Периодическую ферментацию с подпиткой проводили в биореакторе объемом 7,5 л с 3 л ферментационной среды. Размер инокулята составлял 5%. Условия ферментации были установлены на 30 °C, с pH = 6, контролируемым 10 M NaOH.Мы периодически добавляли 800 г/л глюкозы для поддержания концентрации 30 г/л в моменты времени 12, 24, 36, 48 и 72 часа.

Анализ

Оптические плотности при 600 нм (OD 600 ) всех штаммов после 6 дней ферментации измеряли с помощью спектрофотометра Shimadzu UV-2550.

Клетки дрожжей после 6 дней ферментации собирали центрифугированием при 10 000 g в течение 5 мин и измельчали ​​с помощью Bead Beater (BioSpec, США), после чего проводили ультразвуковую экстракцию 2 мл экстракционных растворов (ацетон:метанол = 1:1) 2 раз.Экстракты триметилсилилировали N -метил- N -триметилсилилтрифторацетамидом (Sigma-Aldrich) при 80 °C в течение 30 мин.

Образцы анализировали с помощью ГХ Agilent Technology 7890 в сочетании с трехквадрупольным МС 7000C (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Два микролитра образца вводили в безразделительном режиме при температуре инжектора 300°C. Две колонки HP-5 мс (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США), 15 м * 0,25 мм в.д. * 0.Пленки толщиной 25 мкм были соединены продуваемым конечным соединением (PUU) для обеспечения разделения образцов. Модуль управления пневматикой для реализации обратной продувки во время процедур после запуска управлял PUU. Газ-носитель гелий поддерживался при постоянном потоке для двух колонок, причем первая колонка была настроена на скорость потока 1,1 мл/мин, а вторая — на скорость потока 1,3 мл/мин. Программа температуры колонки была следующей: 1 мин при 80 °C с последующим нагревом колонки до 310 °C со скоростью 20 °C/мин и поддержанием 310 °C в течение 17.5 мин. Во время пост-цикла температуру печи устанавливали на 310 °C на 7 мин, при этом давление инжектора снижали до 2 фунтов на квадратный дюйм, а давление PUU увеличивали до 55 фунтов на квадратный дюйм для обратной продувки менее летучих компонентов матрицы первой колонки.

Температуры линии передачи МС и источника ионов были установлены на 300 °C и 280 °C соответственно. Температура квадруполя составляла Q1 = Q2 = 150 °C, а задержка растворителя составляла 5 мин.

Для количественной оценки мы собрали данные в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) с использованием стандартов сквалена, ланостерола, эргостерола, β-амирина и глицирретиновой кислоты (все они были приобретены у Sigma Aldrich).Два перехода MRM (один для количественного определения и другой для квалификации) были оптимизированы для каждого метаболита и показаны в дополнительном файле 1: Таблица S7.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Производное 18β-глицирретиновой кислоты способствует пролиферации, миграции и экспрессии аквапорина-3 в дермальных фибробластах человека

Abstract

Виды солодки ( Glycyrrhiza ) широко используются в качестве народной медицины и натурального подсластителя пищевых продуктов.18β-глицирретиновая кислота (18β-GA) представляет собой биоактивное соединение солодки, которое обладает потенциальной противораковой, противовоспалительной и противомикробной активностью. Сообщалось, что многие синтезированные производные 18β-GA являются цитотоксическими и предложены для лечения злокачественных заболеваний. В этом исследовании мы изучили возможную фармакологическую роль производного 18β-GA в биологии кожи, используя первичные кожные фибробласты человека и кератиноциты HaCaT в качестве клеточных моделей. Мы обнаружили, что это производное 18β-GA не вызывает гибели клеток, но значительно усиливает пролиферацию дермальных фибробластов и кератиноцитов HaCaT.Анализ заживления царапин показал, что производное 18β-GA способствует миграции фибробластов. Из-за важной роли аквапорина-3 в миграции и пролиферации клеток мы также исследовали экспрессию аквапорина-3 и обнаружили, что это соединение повышает экспрессию аквапорина-3 в дермальных фибробластах и ​​кератиноцитах HaCaT. В дермальных фибробластах производное 18β-GA индуцировало фосфорилирование Akt, ERK и p38. Ингибитор Akt преимущественно подавлял экспрессию аквапорина-3, индуцированную производным 18β-GA.В совокупности это соединение оказывало положительное влияние на пролиферацию, миграцию и экспрессию аквапорина-3 в клетках кожи, что указывает на его потенциальную роль в лечении кожных заболеваний, характеризующихся нарушением заживления ран или кожными дефектами.

Образец цитирования: Хунг С-Ф, Сяо С-Ю, Се У-Х, Ли Х-Дж, Цай Ю-Дж, Линь С-Н и др. (2017) Производное 18β-глицирретиновой кислоты способствует пролиферации, миграции и экспрессии аквапорина-3 в дермальных фибробластах человека. ПЛОС ОДИН 12(8): e0182981.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182981

Редактор: Paula B. Andrade, Universidade do Porto, Faculdade de Farmácia, PORTUGAL

Поступила в редакцию: 13 февраля 2017 г.; Принято: 19 июля 2017 г .; Опубликовано: 16 августа 2017 г.

Авторское право: © 2017 Hung et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и в его файлах вспомогательной информации.

Финансирование: Hung CF при поддержке Министерства науки и технологий Тайваня: MOST 104-2320-B-030 -008 -MY3. Wu NL был поддержан: Министерством науки и технологий Тайваня: MOST 105-2321-B-195-001; МОСТ 105-2314-В-195-006-МУ3; и Мемориальная больница Маккея: MMH-106-17. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Сокращения: 18β-ГА, 18β-глицирретиновая кислота; 18β-GA-d, производное 18β-глицирретиновой кислоты; ТГФ, Тетрагидрофуран, ТГФ; АКП, Аквапорин; ЭРК, киназа p42/44, регулируемая внеклеточным сигналом; JNK, c-Jun Nh3-концевая киназа; МТТ, бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)2,5-дефенилтетразолия; ПМА, форбол 12-миристат-13-ацетат

Введение

Корни и корневища солодки ( Glycyrrhiza ) широко используются в фитотерапии в течение длительного времени.Род Glycyrrhiza (Leguminosae) содержит множество видов и также известен как лакрица, канзо, ганцао, сладкий корень или ясти-мадху [1]. Многие экспериментальные и клинические исследования солодки продемонстрировали ее потенциальные фармакологические свойства, в том числе противовирусное, антимикробное, противовоспалительное, антиоксидантное, антидиабетическое, противоастматическое и противораковое действие в различных системах органов. 2]. Солодка также использовалась в ряде пищевых продуктов из-за ее сладкого вкуса [3] и в качестве ингредиента косметических продуктов для ослабления воспаления и гиперпигментации [4, 5].

Активные компоненты, полученные из видов Glycyrrhiza , включают сапонины, флавоноиды, изофлавоны, кумарины и стильбеноиды [1]. Глицирризиновая кислота (глицирризин), тритерпеноидный сапониновый гликозид, является основным водорастворимым компонентом солодки [3, 6]. Глицирретиновая кислота — еще один природный тритерпеноид солодки, который получают путем гидролиза глицирризиновой кислоты глюкуронидазой; он существует в двух формах: 18α-глицирретиновая кислота (18α-GA) и стереоизомерная форма 18β-глицирретиновая кислота (18β-GA) [6].18β-GA приписывают множественные биологические функции, включая иммуномодуляцию, противовоспалительные эффекты, антиоксидантные реакции и антиканцерогенную активность [3]. 18β-GA представляет собой тритерпен с двумя функциональными группами (COOH и OH) в структуре и может быть получен дешево и легко. Так, на основе его структуры было синтезировано множество производных 18β-ГА [7]. Большинство этих производных цитотоксичны, и их возможные противоопухолевые свойства были оценены [8]. Некоторые производные 18β-GA служат противовоспалительными и антиоксидантными средствами [9].Также сообщалось, что различные производные 18β-GA обладают ингибирующим действием на активность тирозиназы [10].

Хорошо скоординированная пролиферация и миграция кератиноцитов и фибробластов имеет решающее значение для процесса заживления ран [11]. Кератиноциты мигрируют в сторону раневой щели на ранних стадиях, а на последующих стадиях происходит пролиферация и миграция фибробластов [12]. Дермальные фибробласты затем активно и динамично мигрируют к месту раны и экспрессируют важные медиаторы и внеклеточные компоненты, что считается фундаментальным этапом заживления ран [13-15].Кроме того, биологическая активность фибробластов важна в процессе старения кожи. Репликативное старение и функциональные изменения в дермальных фибробластах являются критическими патогенными факторами, и некоторые косметические процедуры, улучшающие состояние стареющей кожи, могут стимулировать устойчивый ответ на заживление ран путем модулирования дермальных фибробластов и дермального внеклеточного матрикса [16].

Аквапорины (AQP), также называемые акваглицеропоринами, представляют собой мембранные белки, которые транспортируют небольшие незаряженные молекулы, такие как глицерин, мочевина и вода [17].AQP широко распространены в тканях, транспортирующих жидкость, таких как почки, и тканях, не транспортирующих жидкость, таких как эпидермис кожи, астроглия и жировая ткань [18]. Среди различных типов AQP AQP-3 является наиболее распространенным, а также наиболее хорошо изученным и подтвержденным [19, 20]. У мышей с нокаутом AQP-3 нарушена гидратация рогового слоя по сравнению с мышами дикого типа [21]. Кроме того, у мышей с нокаутом AQP-3 также наблюдали замедленный процесс заживления ран со сниженной пролиферацией и миграцией кератиноцитов [22].Кроме того, сообщалось, что AQP-3 регулирует миграцию фибробластов кожи человека, что указывает на его роль в процессе заживления ран [23]. Эти данные показали, что AQP-3 играет критическую роль в регуляции пролиферации и миграции клеток кожи.

Предыдущие исследования показали, что производное 18β-GA (18β-GA-d), используемое в этом исследовании, оказывает значительное ингибирующее действие на образование супероксидных анионов в нейтрофилах крыс, стимулированных формил-Met-Leu-Phe/цитохалазином B (fMLP/ CB) или 12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТРА) [9].В этом исследовании мы изучили другие возможные эффекты этого 18β-GA-d на биологические функции кожи, используя первичные кожные фибробласты человека, полученные из крайней плоти взрослых, и кератиноциты HaCaT в качестве клеточных моделей. Сначала мы исследовали влияние этого 18β-GA-d на пролиферацию и миграцию клеток, которые имеют решающее значение для гомеостаза кожи. Кроме того, поскольку AQP-3 является преобладающей AQP кожи, имеющей решающее значение для физиологических функций кожи, таких как пролиферация клеток, миграция и неповрежденная барьерная функция, мы также оценили влияние 18β-GA-d на экспрессию AQP-3. в клетках кожи.

Материалы и методы

Реагенты

Апротинин, 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (MTT), лейпептин, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), фторид натрия (NaF), йодид пропидия, ортованадат натрия, митомицин С, коллаген типа I и тетрагидрофуран (ТГФ) были приобретены у Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури). Антитела (Ab) против AQP-3 (sc-20811), p38 (sc-535), ERK2 (sc-154), JNK1/3 (sc-474) были получены от Santa Cruz Biotechnology (Санта-Крус, Калифорния).Антитела против p-AKT (#9271), Akt (#9272), p-ERK1/2 (#9101), p-P38 (#9211), p-JNK (#9251) и α-тубулина (#2125) были получены от Cell Signaling Technology (Beverely, MA). U0126, MK2206 и SB203580 были получены от Merck Millipore (Billerica, MA). Производное 18β-GA (18β-GA-d) было предоставлено доктором Chun-Nan Lin. Для всех экспериментов в исследовании 18β-GA-d растворяли в ТГФ.

Культура клеток

Первичные кожные фибробласты человека были выделены из крайней плоти взрослых.Образцы крайней плоти были взяты у 8 доноров. Для каждого эксперимента отбирали не менее 3 независимых образцов клеток. Вкратце, кожу разделяли и инкубировали в 1% протеазе (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) в течение ночи при 4°C для отделения дермы от эпидермиса. Кожные части были собраны и разрезаны на мелкие кусочки, а затем выдержаны в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с 10% фетальной телячьей сывороткой (GibcoBRL, Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина (Sigma, Сент-Луис, Миссури).Дермальные фибробласты, которые мигрировали из дермальной ткани, собирали и субкультивировали. Эксперименты проводились в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и были одобрены комитетом по этике Мемориальной больницы Маккея. Перед проведением экспериментов от каждого донора было получено письменное информированное согласие.

Иммортализованные кератиноциты человека (клетки HaCaT) [24] поддерживали в среде DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой (GibcoBRL, Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, Сент-Луис , МО).

Анализ жизнеспособности клеток

Для анализа МТТ клетки высевали в 24-луночные планшеты (30000 клеток/лунку). Вкратце, МТТ (0,5 мг/мл в среде) использовали для количественного определения метаболически активных клеток флакона. Митохондриальные дегидрогеназы метаболизировали МТТ в фиолетовый формазановый краситель, который измеряли фотометрически при 550 нм. Жизнеспособность клеток была пропорциональна измеренному поглощению. Для анализа исключения трипанового синего клетки высевали в 6-луночные планшеты (100000 клеток/лунку). После указанных обработок клетки трипсинизировали 0.5% трипсин-ЭДТА (GibcoBRL, Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) и центрифугировали при 1100 об/мин. Осадок клеток разрушали в культуральной среде и окрашивали трипановым синим для подсчета клеток в ампулах [25].

Вестерн-блот

Процедуру проводили, как описано в предыдущем исследовании [25]. Вкратце, клетки лизировали в буфере для анализа радиоиммунопреципитации и центрифугировали после обработки ультразвуком после указанных обработок. Содержание белка определяли количественно с использованием набора для анализа белков Pierce (Pierce, Rockford, IL), а общий белок оценивали путем проведения электрофореза в 8% SDS-полиакриламидных гелях с последующим электроблоттингом разделенных белков на мембранах PVDF.Добавляли специфические антитела и определяли иммуноблоты с использованием усиленной хемилюминесценции (Chemiluminescence Reagent Plus от NEN, Boston, MA). Результаты количественно оценивали с помощью программного обеспечения Image J (National Institutes of Health, США).

Количественная ПЦР в реальном времени

После указанных обработок клетки лизировали и общую РНК экстрагировали с использованием реагента TRIzol® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). кДНК первой цепи синтезировали с использованием набора для синтеза кДНК первой цепи HiScript I TM (BIONOVAS Biotechnology, Торонто, Онтарио, Канада) в соответствии с инструкциями производителя.ПЦР проводили в 96-луночных планшетах с использованием наборов KAPA SYBR® FAST qPCR KITS (Kapa Biosystems, Wilmington, MA) и определяли с использованием системы обнаружения ПЦР в реальном времени CFX96™ (Bio-Rad, Hercules, CA). Уровень экспрессии мРНК AQP-3 анализировали путем нормализации с помощью гена домашнего хозяйства, β-актина. Специфическими праймерами для AQP-3 человека были: прямой праймер 5′-GACAGAAGGAGCTGGTGTCC-3′ и обратный праймер 5′-ATGAGGATGCCCAGAGTGAC-3′ [26]. Специфическими праймерами для β-актина были: прямой праймер 5′-CGGGACCTGACTGACTACC-3′ и обратный праймер 5′-AGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′ [27].

Анализ заживления царапин in vitro

Для оценки подвижности культивируемых первичных дермальных фибробластов человека мы использовали процедуру царапания, как описано ранее [28]. Вкратце, клетки инкубировали в среде DMEM без сыворотки в течение 24 ч, а раны вводили в конфлюэнтные монослои фибробластов. Затем среду заменяли средой без сыворотки, содержащей 0,1% ТГФ (контрольный носитель) или 3 мкМ, 10 мкМ или 30 мкМ 18β-GA-d. Миграционное состояние фотографировали через 6, 12 и 24 ч после замены среды.

Электрическое измерение импеданса подложки ячейки (ECIS

TM )

Модель ECIS 1600R (Applied BioPhysics, Troy, NY) использовали для анализа миграции дермальных фибробластов человека после обработки ТГФ или 18β-GA-d с использованием процедуры, описанной ранее [28]. Вкратце, каждую лунку ECIS покрывали коллагеном I типа и заполняли бессывороточной средой. Затем в каждую лунку высевали суспензию фибробластов. Разряд переменного тока подавался через небольшие активные электроды в центральной части каждой лунки для нанесения ран.Среду заменяли новой средой, содержащей ТГФ или 18β-GA-d. Раненый участок в каждой лунке постепенно заживал за счет миграции жизнеспособных клеток. Миграционную реакцию измеряли в режиме реального времени путем регистрации восстановления электрического импеданса.

Статистический анализ

Данные были выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего по крайней мере трех независимых экспериментов. Был проведен однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным тестом Тьюки. P < 0,05 считалось показателем статистической значимости.Все статистические анализы проводились с использованием SPSS ver. Программное обеспечение 21.0 (IBM, Армонк, Нью-Йорк).

Результат

Рост дермальных фибробластов человека усиливался под действием 18β-GA-d

Как показано на рис. 1, 18β-GA-d был получен из химической структуры 18β-GA после модификации в положении C3. Чтобы изучить потенциальное воздействие этого 18β-GA-d на кожу, мы использовали первичные кожные фибробласты человека, полученные из кожи взрослого человека, в качестве клеточной модели. Фибробласты кожи человека обрабатывали 18β-GA-d в течение 24 часов.Анализ МТТ показал, что относительное количество клеток увеличивалось дозозависимым образом (рис. 2А). Чтобы подтвердить это наблюдение, мы использовали анализ исключения трипанового синего для подсчета жизнеспособных клеток и обнаружили значительное усиление роста клеток после обработки 18β-GA-d. Эти результаты означают, что 18β-GA-d не был токсичным для дермальных фибробластов человека в этих концентрациях и что он способствовал росту дермальных фибробластов человека.

Рис. 1. Химическая структура производного 18β-глицирретиновой кислоты.

Химическая структура производного 18β-глицирретиновой кислоты (18β-GA-d) и различия между 18β-GA-d и 18β-GA.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182981.g001

Рис. 2. 18β-GA-d увеличивает пролиферацию фибробластов кожи человека.

Фибробласты кожи человека обрабатывали 0,1% ТГФ (контроль) или различными дозами 18β-GA-d (3, 10, 30 мкМ) в течение 24 часов. Пролиферацию клеток анализировали с помощью анализа МТТ (А) и анализа исключения трипанового синего (В).* p <0,05 (среднее ± SEM n = 3).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182981.g002

18β-GA-d способствует миграции дермальных фибробластов человека

Чтобы оценить другие потенциальные эффекты 18β-GA-d на дермальные фибробласты человека, мы использовали тест in vitro на заживление царапин для изучения влияния 18β-GA-d на подвижность дермальных фибробластов человека. Как показано на рис. 3А, мы применяли разные дозы 18β-GA-d и наблюдали за состоянием миграции в разное время.Рана заживала быстрее в группе, получавшей 18β-GA-d, чем в контрольной группе. Однако, поскольку 18β-GA-d может способствовать росту дермальных фибробластов человека, это может повлиять на оценку анализа царапин; поэтому мы использовали митомицин С для ингибирования роста клеток. Даже после лечения митомицином С площадь раны была меньше в группе, получавшей 18β-GA-d, чем в контрольной группе (рис. 3В). Эти результаты показали, что 18β-GA-d может улучшать миграционную способность клеток посредством механизма, не связанного с увеличением числа клеток.Кроме того, мы использовали измерение электрического импеданса клеток (ECIS) для исследования динамических изменений в миграции клеток. Как показано на рис. 3C, 10 и 30 мкМ 18β-GA-d увеличивали импеданс с течением времени, указывая на усиление миграции клеток после обработки 18β-GA-d.

Рис. 3. 18β-GA-d увеличивает миграцию фибробластов кожи человека.

(A) Фибробласты кожи человека обрабатывали 0,1% ТГФ или различными дозами 18β-GA-d (3, 10 и 30 мкМ) и наблюдали в разное время (6, 12 и 24 ч). Был проведен анализ заживления царапин in vitro . Миграцию клеток анализировали с помощью фазово-контрастного микроскопа. Масштабная линейка = 200 мкм. (B) Кожные фибробласты человека обрабатывали митомицином C (mit) (10 мкг/мл) и 18β-GA-d (30 мкМ) и наблюдали через 24 часа после обработки. Масштабная линейка = 200 мкм. (C) Дермальные фибробласты человека в лунках с микроэлектродами Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) были повреждены высоким электрическим напряжением. Среду заменяли новой средой, содержащей 0.1% ТГФ или различные дозы 18β-GA-d (3, 10 и 30 мкМ), а миграцию клеток определяли с помощью ECIS. Миграцию фибробластов в область раны с помощью электродов анализировали с помощью измерения электрического импеданса в реальном времени.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182981.g003

Повышенная экспрессия AQP-3 в дермальных фибробластах человека, индуцированная 18β-GA-d

Из-за хорошо известной роли AQP-3 в росте клеток и заживлении кожных ран [22] мы исследовали влияние 18β-GA-d на экспрессию AQP-3 в дермальных фибробластах человека.Мы оценили экспрессию мРНК AQP-3 в дермальных фибробластах человека с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Результаты показали, что 18β-GA-d значительно индуцировал экспрессию мРНК AQP-3 с оптимальным эффектом через 6 часов (рис. 4А). Что касается экспрессии белка, мы обнаружили, что 30 мкМ 18β-GA-d повышали экспрессию AQP-3 в дермальных фибробластах человека, в то время как 3 мкМ 18β-GA-d не индуцировали эффективно экспрессию AQP-3 (рис. 4Б).

Рис. 4. 18β-GA-d индуцирует экспрессию AQP-3 в дермальных фибробластах человека.

(A) Фибробласты кожи человека обрабатывали 0,1% ТГФ или 18β-GA-d (30 мкМ) и собирали в разное время (3, 6, 9 ч). Экспрессию мРНК AQP-3 относительно ТГФ в каждый момент времени анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. (B) Кожные фибробласты человека обрабатывали 0,1% ТГФ или различными дозами 18β-GA-d (3, 10, 30 мкМ) в течение 24 часов. Экспрессию белка AQP-3 анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Данные количественного определения соотношения AQP-3/α-тубулина в группе, получавшей 18β-GA-d, по отношению к AQP-3/α-тубулину в группе, получавшей ТГФ, показаны на нижней панели.* p <0,05 (среднее ± SEM n = 3).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182981.g004

Передача сигналов, индуцированная 18β-GA-d в дермальных фибробластах человека

Предыдущие отчеты указывали на участие сигнальных путей Akt, ERK и p38 в миграции и пролиферации фибробластов; эти пути также важны для регуляции экспрессии AQP-3, индуцированной различными стимулами [23, 29, 30]. Поэтому мы исследовали влияние 18β-GA-d на активацию этих родственных сигнальных молекул в дермальных фибробластах человека.Как показано на фиг. 5А, обработка 18β-GA-d может постепенно индуцировать фосфорилирование Akt, ERK1/2 и p38 по сравнению с обработкой контрольным носителем ТГФ. Фосфорилирование JNK, индуцированное ТГФ или 18β-GA-d, почти не обнаруживалось (данные не показаны). Эти результаты показали, что пути Akt, ERK1/2 и p38, возможно, могут регулировать фармакологические эффекты 18β-GA-d на дермальные фибробласты человека. Затем мы изучили возможные пути, регулирующие экспрессию AQP-3, индуцированную 18β-GA-d.Применяли фармакологические ингибиторы ERK, p38 и Akt. Мы обнаружили, что ингибиторы Akt и p38 значительно снижают экспрессию AQP-3, индуцированную 18β-GA-d, а ингибитор Akt преимущественно подавляет индукцию AQP-3, что указывает на критическую роль активации Akt в регуляции 18β-GA-d. -индуцированная экспрессия AQP-3.

Рис. 5. 18β-GA-d повышал фосфорилирование Akt, ERK1/2 и p38 в дермальных фибробластах человека.

(A) Фибробласты кожи человека обрабатывали 0.1% ТГФ или 18β-GA-d (30 мкМ) в разное время. Уровень фосфорилирования Akt, ERK1/2 и р38 в разное время анализировали методом вестерн-блоттинга. Данные количественного определения отношения фосфорилированного белка/общего нефосфорилированного белка в группах, получавших ТГФ и 18β-GA-d, к таковым в необработанных группах показаны на нижних панелях. * p <0,05 по сравнению с обработкой ТГФ в тот же момент времени (среднее значение ± стандартная ошибка среднего n = 3). (B) Дермальные фибробласты человека предварительно обрабатывали UO126 (ингибитором ERK) (20 мкМ), MK2206 (ингибитором Akt) (5 мкМ) или SB203580 (ингибитором p38) (10 мкМ), а затем обрабатывали 0.1% ТГФ или 18β-GA-d (30 мкМ) на 24 часа. Экспрессию белка AQP-3 оценивали с помощью вестерн-блоттинга. Данные количественного определения соотношения AQP-3/α-тубулина в разных группах по отношению к AQP-3/α-тубулину в группе, получавшей ТГФ, показаны на правой панели. * p <0,05 (среднее ± SEM n = 3).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182981.g005

18β-GA-d усиливал пролиферацию и миграцию кератиноцитов HaCaT

Затем мы исследовали, оказывает ли 18β-GA-d подобное воздействие на кератиноциты.Мы оценили рост и миграцию клеточной линии кератиноцитов человека, HaCaT, после обработки 18β-GA-d. После обработки кератиноцитов HaCaT 18β-GA-d в различных концентрациях мы наблюдали значительное увеличение числа клеток, измеренное с помощью анализа МТТ; особенно заметный эффект оказывали 30 мкМ 18β-GA-d (фиг. 6А). Анализ исключения трипанового синего подтвердил влияние 18β-GA-d на HaCaT (рис. 6B). Кроме того, мы провели анализ заживления царапин in vitro и показали, что 18β-GA-d может стимулировать подвижность кератиноцитов HaCaT (рис. 6C).

Рис. 6. 18β-GA-d увеличивает пролиферацию клеток в кератиноцитах HaCaT.

(A) Кератиноциты HaCaT обрабатывали 0,1% ТГФ или различными дозами 18β-GA-d (3, 10 и 30 мкМ) в течение 24 часов. Относительное количество клеток анализировали с помощью анализа МТТ. (B) Подобно (A), относительное количество клеток определяли с использованием анализа исключения трипанового синего. (C) Кератиноциты HaCaT обрабатывали 0,1% ТГФ или различными дозами 18β-GA-d (3, 10 и 30 мкМ), и проводили анализ заживления царапин in vitro .Миграцию клеток наблюдали в разное время (0 и 24 ч). Масштабная линейка = 200 мкм. * p <0,05 (среднее ± SEM n = 3).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182981.g006

18 β-GA-d индуцирует экспрессию AQP-3 в кератиноцитах HaCaT

Поскольку было обнаружено, что 18β-GA-d способен стимулировать рост и миграцию кератиноцитов HaCaT, мы исследовали, может ли он индуцировать экспрессию AQP-3. Мы обработали клетки HaCaT 30 мкМ 18β-GA-d и обнаружили, что экспрессия AQP-3 индуцируется (рис. 7А).Однако значительная индукция AQP-3 в кератиноцитах HaCaT была обнаружена в более позднее время, через 48 ч после обработки, чем в дермальных фибробластах человека. Что касается эффекта дозировки, 10 и 30 мкМ 18β-GA-d индуцировали экспрессию AQP-3 в кератиноцитах HaCaT, но 3 мкМ 18β-GA-d не вызывали значительных эффектов. Эти данные свидетельствуют о том, что 30 мкМ 18β-GA-d оказывают на кератиноциты такое же фармакологическое действие, как и на дермальные фибробласты человека, хотя воздействие на кератиноциты может быть более мягким, чем на фибробласты.

Рис. 7. 18β-GA-d индуцирует экспрессию AQP-3 в кератиноцитах HaCaT.

(A) Кератиноциты HaCaT обрабатывали 0,1% ТГФ или 18β-GA-d (30 мкМ) в разное время (6, 12, 24 и 48 ч). Экспрессию белка AQP-3 анализировали вестерн-блоттингом. (B) Кератиноциты HaCaT обрабатывали 0,1% ТГФ или различными дозами 18β-GA-d (3, 10 и 30 мкМ) в течение 48 часов. Экспрессию белка AQP-3 анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Данные количественного определения соотношения AQP-3/α-тубулина в группе, получавшей 18β-GA-d, по отношению к AQP-3/α-тубулину в группе, получавшей ТГФ, показаны на нижней панели.* p <0,05 (среднее ± SEM n = 3).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182981.g007

Обсуждение

Известно, что изоформы 18α-GA и 18β-GA проявляют цитотоксическое или супрессивное действие на рост клеток и были подвергнуты различным исследованиям рака [6, 7]. Сообщалось, что 18α-GA может ингибировать пролиферацию клеток или индуцировать апоптоз в клеточных линиях рака молочной железы и простаты [31, 32]. Также было показано, что он обладает выраженной противораковой активностью; он ингибирует рост или индуцирует апоптоз в различных линиях раковых клеток.Также было показано, что он регулирует иммуномодуляцию, как in vitro , так и in vivo [7]. Многие синтезированные производные ГК также проявляют значительную цитотоксическую активность [7, 33]. Положительное влияние 18α-GA, 18β-GA и их производных на пролиферацию клеток подробно не изучалось. В нашем исследовании было показано, что рост дермальных фибробластов и эпидермальных кератиноцитов стимулируется 18β-GA-d, который имеет отчетливую фармакологическую функцию. В отличие от других 18β-GA-ds, это соединение значительно усиливало рост фибробластов и кератиноцитов: поразительно уникальный эффект.Это соединение также способствовало миграции фибробластов и кератиноцитов. Таким образом, в дополнение к разработке 18β-GA-ds, которые могут индуцировать апоптоз, также важно разработать нецитотоксические производные 18β-GA, такие как соединение в этом исследовании, и оценить их возможную фармакологическую роль при незлокачественных заболеваниях, включая различные кожные заболевания, характеризующиеся плохим заживлением ран или атрофическими поражениями кожи.

До сих пор большинство GA-d были синтезированы на основе структуры 18β-GA, а не стереоизомерной формы 18α.Структурные или химические модификации 18β-GA обычно сосредоточены на функциональных группах кольца A, C, E или нескольких колец [7, 8]. Многие 18β-GA-д проявляют заметную цитотоксическую активность [7, 33, 34], а большинство цитотоксических 18β-GA-д проявляют оптимальную цитотоксичность при концентрациях менее 30 мкМ [7]. Было показано, что введение двойной связи при С1-С2 в кольце А с электроотрицательной функциональной группой при С2 и окисление гидроксильной группы С3 в карбонильную группу увеличивает цитотоксичность [7].Также было показано, что этерификация карбоксильной группы С-30 изменяет полярность и улучшает противоопухолевую активность [8]. В предыдущем исследовании мы исследовали противовоспалительную и антиоксидантную активность различных GA-ds со структурными модификациями при расщеплении кольца A или введении различных сложноэфирных групп в C-3 и C-30. Многие 18β-GA-ds, включая соединение, используемое в этом исследовании, продемонстрировали способность ингибировать окислительный стресс в нейтрофилах или образование фактора некроза опухоли (TNF)-α в RAW 264.7 клеток [9]. Необходимо провести дальнейшие исследования, чтобы изучить способность этих 18β-GA-ds предотвращать окислительные повреждения кератиноцитов и фибробластов кожи, такие как повреждения клеток, вызванные УФ-А и/или УФ-В [35, 36]. Изучаются неизвестные потенциальные биологические эффекты других родственных соединений.

В дополнение к влиянию на рост и миграцию клеток, 18β-GA-d, используемый в этом исследовании, может также повышать экспрессию аквапорина-3 (AQP-3) в фибробластах и ​​кератиноцитах.AQP-3 имеет решающее значение для многих основных физиологических функций кожи, таких как увлажнение кожи и восстановление барьера [20]. AQP-3 также играет важную роль в эпидермальной пролиферации и миграции, и было показано, что заживление кожных ран у мышей с нокаутом AQP-3 нарушено [22, 37]. Кроме того, AQP-3 играет незаменимую роль в регуляции миграции кожно-дермальных фибробластов, стимулируемой эпидермальным фактором роста (EGF), что указывает на его роль в нормальном процессе заживления ран [23].Недавнее исследование показало, что местное лечение эритропоэтином может индуцировать экспрессию AQP-3 в коже и способствовать процессу заживления ожоговых ран у свиней с диабетом посредством AQP-3-зависимого пути [38]. Эти отчеты предполагают, что важно разработать многообещающие новые фармакологические агенты, которые могут способствовать заживлению ран при кожных заболеваниях путем регуляции экспрессии AQP-3 в коже.

Что касается регуляции экспрессии AQP-3, в предыдущем отчете было показано, что EGF может запускать активацию сигнальных путей EGFR, PI3K и ERK для регуляции экспрессии AQP-3 в дермальных фибробластах, которая участвует в миграции фибробластов [23]. .В нашем исследовании 18β-GA-d значительно повышал экспрессию AQP-3 в дермальных фибробластах и ​​индуцировал фосфорилирование Akt, ERK и p38. Ингибирование Akt фармакологическими ингибиторами преимущественно снижает экспрессию AQP-3, индуцированную 18β-GA-d, что позволяет предположить, что сигнальные пути Akt играют важную регуляторную роль. Насколько нам известно, очень немногие соединения, родственные солодке, могут регулировать экспрессию AQP-3 [39–41], а другие известные 18β-GA-d никогда не сообщали о том, что они регулируют экспрессию AQP-3 в кератиноцитах или фибробластах. предполагая, что этот 18β-GA-d был уникальным.Кроме того, мы исследовали влияние этого 18β-GA-d на экспрессию AQP-9 и AQP-10 в дермальных фибробластах и ​​обнаружили, что также индуцируются мРНК AQP-9 и AQP-10 (данные не показаны). Однако известные функции AQP-9 и AQP-10 в фибробластах кожи очень ограничены, и их значение требует дальнейшего изучения.

Результаты клеточных экспериментов in vitro в этом исследовании продемонстрировали значительное влияние 18β-GA-d на биологические функции первичных дермальных фибробластов человека; однако у этого исследования есть некоторые ограничения.Функции in vivo 18β-GA-d неизвестны и требуют дальнейших исследований на животных. Модели кожных заболеваний мышей, характеризующиеся нарушением заживления ран, такие как модель диабетической раны, или поврежденными эпидермальными кератиноцитами и дермальными фибробластами, такие как модели УФА/УФБ-облучения, могут быть использованы для будущих исследований [22, 25, 38]. Кроме того, известно, что активация AQP-3 связана с пролиферативными поражениями кожи, такими как атопический дерматит [42] или плоскоклеточный рак кожи [43].Потенциальные эффекты AQP-3-индуцирующего свойства этого соединения на пролиферативные заболевания кожи неизвестны и должны быть исследованы.

В заключение мы продемонстрировали, что синтезированный 18β-GA-d не токсичен для клеток кожи, но может способствовать их миграции, пролиферации и экспрессии AQP-3. Результаты этого исследования in vitro проложат путь для дальнейших исследований возможного воздействия этого соединения на различные кожные заболевания.

Каталожные номера

  1. 1.Asl MN, Hosseinzadeh H. Обзор фармакологических эффектов Glycyrrhiza sp. и его биологически активные соединения. Фитотер Рез. 2008;22(6):709–24. пмид: 18446848.
  2. 2. Hosseinzadeh H, Nassiri-Asl M. Фармакологические эффекты Glycyrrhiza spp. и его биологически активные составляющие: обновление и обзор. Фитотер Рез. 2015; 29(12):1868–86. пмид: 26462981.
  3. 3. Као ТС, Ву Ч, Йен ГК. Биоактивность и потенциальная польза солодки для здоровья. J Agric Food Chem.2014;62(3):542–53. пмид: 24377378.
  4. 4. Саиди М., Мортеза-Семнани К., Горейши М.Р. Лечение атопического дерматита гелем солодки. J Дерматолог лечить. 2003;14(3):153–157. пмид:14522625.
  5. 5. Callender VD, St Surin-Lord S, Davis EC, Maclin M. Поствоспалительная гиперпигментация: этиологические и терапевтические соображения. Am J Clin Дерматол. 2011;12(2):87–99. пмид: 21348540.
  6. 6. Ван Зи, Агарвал Р, Чжоу Зи, Бикерс Д.Р., Мухтар Х.Ингибирование мутагенности у Salmonella typhimurium и активности по инициированию опухоли кожи и развитию опухоли у мышей SENCAR с помощью глицирретиновой кислоты: сравнение 18 альфа- и 18 бета-стереоизомеров. Канцерогенез. 1991;12(2):187–92. пмид: 1899808.
  7. 7. Рубахш А., Ираншахи М., Ираншахи М. Глицирретиновая кислота и ее производные: противораковые и противораковые химиопрофилактические свойства, механизмы действия и взаимосвязь между структурой и цитотоксической активностью. Курр Мед Хим. 2016;23(5):498–517.пмид: 26758798.
  8. 8. Сюй Б., Ву Г.Р., Чжан Сюй, Ян М.М., Чжао Р., Сюэ Н.Н. и др. Обзор структурно модифицированных производных глицирретиновой кислоты в качестве противоопухолевых агентов. Молекулы. 2017;22(6). пмид: 28574470.
  9. 9. Maitraie D, Hung CF, Tu HY, Liou YT, Wei BL, Yang SC, et al. Синтез, противовоспалительная и антиоксидантная активность производных 18бета-глицирретиновой кислоты как химических медиаторов и ингибиторов ксантиноксидазы. Биоорг Мед Хим. 2009;17(7):2785–92.пмид: 19278854.
  10. 10. Ум С.Дж., Пак М.С., Пак С.Х., Хан Х.С., Квон Ю.Дж., Син Х.С. Синтез новых производных глицирретиновой кислоты (ГК) и их влияние на активность тирозиназы. Биоорг Мед Хим. 2003;11(24):5345–52. пмид: 14642578.
  11. 11. Вернер С., Криг Т., Смола Х. Взаимодействие кератиноцитов и фибробластов при заживлении ран. Джей Инвест Дерматол. 2007;127(5):998–1008. пмид: 17435785.
  12. 12. Брайман-Виксман Л., Соломоник И., Спира Р., Тенненбаум Т. Новое понимание последовательности событий заживления ран.Токсикол патол. 2007;35(6):767–79. пмид: 17943650.
  13. 13. Трейси Л.Э., Минасян Р.А., Катерсон Э.Дж. Функция внеклеточного матрикса и дермальных фибробластов в заживающей ране. Adv Wound Care (Нью-Рошель). 2016;5(3):119–36. пмид: 26989578; Центральный PMCID PubMed: PMCPMC4779293.
  14. 14. Гриннелл Ф. Фибробласты, миофибробласты и сокращение раны. Джей Селл Биол. 1994;124(4):401–4. пмид:8106541; Центральный PMCID PubMed: PMCPMC2119916.
  15. 15. Лауффенбургер Д.А., Хорвиц А.Ф.Миграция клеток: физически интегрированный молекулярный процесс. Клетка. 1996;84(3):359–69. пмид:8608589.
  16. 16. Фишер Дж.Дж., Варани Дж., Вурхиз Дж.Дж. Выглядит старше: коллапс фибробластов и терапевтические последствия. Арка Дерматол. 2008;144(5):666–72. пмид: 184; Центральный PMCID PubMed: PMCPMC2887041.
  17. 17. Ройек А., Преториус Дж., Фрокьер Дж., Нильсен С., Фентон Р.А. Современный взгляд на акваглицеропорины млекопитающих. Annu Rev Physiol. 2008;70:301–27. пмид: 17961083.
  18. 18. Веркман АС. Больше, чем просто водные каналы: неожиданная клеточная роль аквапоринов. Дж. Клеточные науки. 2005; 118 (часть 15): 3225–32. пмид: 16079275.
  19. 19. Бури-Жамот М., Дараспе Дж., Бонте Ф., Перрье Э., Шнеберт С., Дюма М. и др. Аквапорины кожи: участвуют в гидратации, заживлении ран и гомеостазе эпидермиса кожи. Handb Exp Pharmacol. 2009;(190):205–17. пмид: 179.
  20. 20. Хара-Чикума М., Веркман А.С. Роль аквапорина-3 в эпидермисе.Джей Инвест Дерматол. 2008;128(9):2145–51. пмид: 18548108.
  21. 21. Ма Т., Хара М., Суграт Р., Вербавац Дж. М., Веркман А. С. Нарушение гидратации рогового слоя у мышей, лишенных эпидермального водного канала аквапорина-3. Дж. Биол. Хим. 2002;277(19):17147–53. пмид: 11880378.
  22. 22. Хара-Чикума М., Веркман А.С. Аквапорин-3 способствует миграции и пролиферации эпидермальных клеток во время заживления ран. J Mol Med (Берл). 2008;86(2):221–31. пмид: 17968524.
  23. 23. Цао С., Сунь И., Хили С., Би З., Ху Г., Ван С. и др.Опосредованная EGFR экспрессия аквапорина-3 участвует в миграции фибробластов кожи человека. Биохим Дж. 2006;400(2):225–34. пмид: 16848764; Центральный PMCID PubMed: PMCPMC1652825.
  24. 24. Букамп П., Петрушевска Р.Т., Брейткройц Д., Хорнунг Дж., Маркхэм А., Фузениг Н.Е. Нормальная кератинизация в спонтанно иммортализованной анеуплоидной клеточной линии кератиноцитов человека. Джей Селл Биол. 1988;106(3):761–71. пмид: 2450098; Центральный PMCID PubMed: PMCPMC2115116.
  25. 25. Huang CH, Li HJ, Wu NL, Hsiao CY, Lin CN, Chang HH, et al.Фотозащитные эффекты циклогетерофиллина против вызванных УФ-А повреждений и окислительного стресса в фибробластах кожи человека. ПЛОС Один. 2016;11(9):e0161767. пмид: 27583973; Центральный PMCID PubMed: PMCPMC5008741.
  26. 26. Цзян Ю.Дж., Ким П., Лу Ю.Ф., Фейнгольд К.Р. Активаторы PPARgamma стимулируют экспрессию аквапорина 3 в кератиноцитах/эпидермисе. Опыт Дерматол. 2011;20(7):595–9. пмид: 21457357; Центральный PMCID PubMed: PMCPMC3120929.
  27. 27. Ву Н.Л., Хуан Д.Ю., Цоу Х.Н., Линь Ю.К., Линь В.В.Syk опосредует индуцированную IL-17 экспрессию CCL20 путем нацеливания на Act1-зависимое K63-связанное убиквитинирование TRAF6. Джей Инвест Дерматол. 2015;135(2):490–8. пмид: 25202827.
  28. 28. Ву Н.Л., Чан Ю.С., Хуан К.С., Фанг Д.Ю., Чен Д.Ф., Хунг С.Ф. Зеаксантин ингибирует вызванную PDGF-BB миграцию в дермальных фибробластах человека. Опыт Дерматол. 2010;19(8):e173–81. пмид:20482615.
  29. 29. Etscheid M, Beer N, Dodt J. Протеаза, связывающая гиалуронан, активирует сигнальные пути ERK1/2 и PI3K/Akt в фибробластах и ​​стимулирует пролиферацию и миграцию клеток.Сотовый сигнал. 2005;17(12):1486–94. пмид: 16153533.
  30. 30. Song J, Xu H, Lu Q, Xu Z, Bian D, Xia Y и др. Мадекассозид подавляет миграцию фибробластов из келоидов: вовлечение киназы p38 и сигнальных путей PI3K. Бернс. 2012;38(5):677–84. пмид: 22360962.
  31. 31. Росси Т., Кастелли М., Зандоменеги Г., Руберто А., Бенасси Л., Маньони С. и др. Избирательность действия производных глицирризина на рост клеток MCF-7 и HEP-2. Противораковый Рез.2003;23(5А):3813–8. пмид: 14666682.
  32. 32. Шетти А.В., Тиругнанам С., Дакшинамурти Г., Самыкутти А., Чжэн Г., Чен А. и др. 18-альфа-глицирретиновая кислота нацелена на клетки рака предстательной железы, подавляя гены, связанные с воспалением. Int J Oncol. 2011;39(3):635–40. пмид: 21637916.
  33. 33. Csuk R, Schwarz S, Siewert B, Kluge R, Strohl D. Синтез и противоопухолевая активность производных глицирретиновой кислоты, модифицированных кольцом A. Eur J Med Chem. 2011;46(11):5356–69.пмид:21959232
  34. 34. Csuk R, Schwarz S, Kluge R, Strohl D. Улучшение цитотоксичности и избирательности опухоли глицирретиновой кислоты путем дериватизации бифункциональными аминокислотами. Арч Фарм (Вайнхайм). 2011;344(8):505–13. пмид: 21674592.
  35. 35. Kong SZ, Chen HM, Yu XT, Zhang X, Feng XX, Kang XH и др. Защитный эффект 18бета-глицирретиновой кислоты от УФ-облучения вызывал фотостарение у мышей. Опыт Геронтол. 2015;61:147–55. пмид: 25498537.
  36. 36. Вератти Э., Росси Т., Джудиче С., Бенасси Л., Бертаццони Г., Морини Д. и др. 18бета-глицирретиновая кислота и глабридин предотвращают окислительную фрагментацию ДНК в культурах кератиноцитов человека, облученных УФ-В. Противораковый Рез. 2011;31(6):2209–15. пмид:21737643
  37. 37. Хара М., Ма Т., Веркман А.С. Избирательно восстановленный глицерин в коже мышей с дефицитом аквапорина-3 может быть причиной нарушения гидратации кожи, ее эластичности и восстановления барьера. Дж. Биол. Хим. 2002;277(48):46616–21.пмид:12270942.
  38. 38. Хамед С., Ульманн Ю., Эгози Д., Керен А., Даод Э., Анис О. и др. Местное лечение эритропоэтином ускоряет заживление кожных ожогов у свиней с диабетом посредством механизма, зависящего от аквапорина-3. Диабет. 2017. пмид: 28546424.
  39. 39. Канг Д.Г., Сон Э.Дж., Ли Х.С. Влияние глицирризина на функции почек в связи с регуляцией водных каналов. Am J Chin Med. 2003;31(3):403–13. пмид: 12943171.
  40. 40.Абурада Т., Икараши Н., Кагами М., Итикава Ю., Сугитани М., Манива А. и др. Byakkokaninjinto предотвращает потерю воды организмом за счет повышения экспрессии почечного аквапорина-2 и кожного аквапорина-3 у мышей KKAy. Фитотер Рез. 2011;25(6):897–903. пмид: 21110398.
  41. 41. Ma SK, Nam KI, Kim SW, Bae EH, Choi KC, Lee J. Повышенная почечная экспрессия аквапорина-3 у крыс ингибирует 11бета-гидроксистероиддегидрогеназу 2 типа. Почечный пресс крови Res. 2007;30(1):8–14. пмид: 17213730.
  42. 42. Накахигаси К., Кабашима К., Икома А., Веркман А.С., Миячи Ю., Хара-Чикума М. Активация аквапорина-3 участвует в пролиферации кератиноцитов и эпидермальной гиперплазии. Джей Инвест Дерматол. 2011;131(4):865–73. пмид: 211.
  43. 43. Хара-Чикума М., Веркман А.С. Профилактика онкогенеза кожи и нарушения пролиферации эпидермальных клеток путем направленного разрушения гена аквапорина-3. Мол Селл Биол. 2008;28(1):326–32. пмид: 17967887; Центральный PMCID PubMed: PMCPMC2223314.

Простой метод оценки фармакокинетики глицирретиновой кислоты и потенциального лекарственного взаимодействия растительных ингредиентов

  • Fukai, T. et al . Антихеликобактерные флавоноиды из экстракта солодки. Науки о жизни. 71 , 1449–1463 (2002).

    КАС Статья Google ученый

  • Сян, К. и др. . От отдельных соединений к растительным экстрактам: стратегия систематической характеристики метаболитов солодки у крыс. Препарат Метаб. дисп. 39 , 1597–1608 (2011).

    КАС Статья Google ученый

  • Асл, М. Н. и Хоссейнзаде, Х. Обзор фармакологических эффектов Glycyrrhiza sp. и его биологически активные соединения. Фитотерм. Рез. 22 , 709–724 (2008).

    КАС Статья Google ученый

  • Амагая, С. и др. .Сравнительные исследования стереоизомеров глицирретиновой кислоты на противовоспалительную активность. Дж. Фарм. Дин. 7 , 923–928 (1984).

    КАС Статья Google ученый

  • Гао, З., Канг, X. и Сюй, К. Ход исследования противоракового механизма глицирретиновой кислоты. Китай Дж. Чин. Матер. Мед. 36 (22), 3213–3216 (2011).

    КАС Google ученый

  • Ван, Дж. и др. . Биоконверсия глицирризиновой кислоты в солодке в 18-бетаглицирретиновую кислоту с помощью Aspergillus parasiticus speare BGB. Прикл. Биохим. микробиол. 46 (4), 462–466 (2010).

    КАС пабмед Google ученый

  • Кисо Ю. и др. . Механизм антигепатотоксического действия глицирризина I, влияние на генерацию свободных радикалов и перекисное окисление липидов. Планта Мед. 50 , 298–302 (1984).

    КАС Статья Google ученый

  • Яно С. и др. . Противоязвенная активность производных глицирретиновой кислоты на экспериментальных моделях поражения желудка. Хим. Фарм. Бык. 37 (9), 2500–2504 (1989).

    КАС Статья Google ученый

  • Хуан, Р. Ю. и др. . 18 – Глицирретиновая кислота подавляет пролиферацию клеток за счет ингибирования тромбоксансинтазы при немелкоклеточном раке легкого. PLoS ONE 9 , 0093690, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0093690 (2014).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья Google ученый

  • Хуан Ю. К. и др. . 18-глицирретиновая кислота индуцирует апоптоз клеток лейкемии человека HL-60 посредством каспаз- и митохондриально-зависимых сигнальных путей. Молекулы 21 , 21070872, https://doi.org/10.3390/molecules21070872 (2016).

    КАС Статья Google ученый

  • Маццокки, Г. и др. . Экспрессия и активность 11β-гидроксистероиддегидрогеназы в коре надпочечников человека. FASEB J. 12 (14), 1533–1539 (1998).

    КАС Статья Google ученый

  • Набекура, Т., Ямаки, Т., Уэно, К. и Китагава, С. Ингибирование P-гликопротеина и белка множественной лекарственной устойчивости 1 диетическими фитохимическими веществами. Рак Химия. Фармакол. 62 , 867–873 (2008).

    КАС Статья Google ученый

  • Lin, S.P., Tsai, S.Y., Hou, YC и Chao, PD. Глицирризин и солодка значительно влияют на фармакокинетику метотрексата у крыс. Дж. Сельское хозяйство. Пищевая хим. 57 , 1854–1859 (2009).

    КАС Статья Google ученый

  • Ван, В. П. и др. . Фармакокинетические исследования значения травяной совместимости отвара солодки пиона. Режим. традиц. Подбородок. Мед. Матер. Мед. 11 (3), 382–387 (2009).

    Google ученый

  • Tang, Y., Zheng, M., Chen, Y.L., Chen, J. & He, Y. Фармакокинетические эффекты коричной кислоты, амигдалина, глицирризиновой кислоты и ликиритина на алкалоиды эфедры у крыс, Eur. J. Препарат метаб. РН. 42 (3), 1–9 (2017).

    Google ученый

  • Саиди М., Мортеза-Семнани, К. и Горейши, М.Р. Лечение атопического дерматита гелем солодки. J. Дерматол. Обращаться. 14 (3), 153–157 (2003).

    КАС Статья Google ученый

  • Li, X.L., Zhou, A.G., Zhang, L. & Chen, WJ. Антиоксидантный статус и иммунная активность глицирризина у мышей с аллергическим ринитом. Междунар. Дж. Мол. науч. 12 (2), 905–916 (2011).

    КАС Статья Google ученый

  • Ван, П. и др. . Одновременное определение эналаприла и эналаприлата в плазме человека методом ЖХ-МС: применение в исследовании биоэквивалентности. Хроматография 65 , 209–215 (2007).

    КАС Статья Google ученый

  • Suzuki, T. и др. . Высокочувствительный метод ЖХ-МС/МС для одновременного определения глицирризина и его активного метаболита глицирретиновой кислоты: применение в фармакокинетических исследованиях человека после перорального приема.Биомед. Хроматогра. 31 (12), 4032, https://doi.org/10.1002/bmc.4032 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Ван, К. Х. и др. . Фармакокинетическое исследование нескольких активных компонентов отвара Kushen-Gancao после перорального введения крысам с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Ж. Хроматогра. B 965 , 19–26 (2014).

    КАС Статья Google ученый

  • Ван, Дж.L., Zheng, DD, Wang, YZ, Zhang, C. & Sun, X. Изучение фармакокинетики экстрактов отвара Erhuang на крысах с помощью ВЭЖХ–МС/МС. J. Хроматогра. B 1059 , 35–42 (2017).

    КАС Статья Google ученый

  • Вен, Дж. и др. . УЭЖХ-МС/МС определение пеонифлорина, нарингина, нарингенина и глицирретиновой кислоты в плазме крыс и его применение в фармакокинетическом исследовании после перорального приема отвара Si Ni San. Дж. Фармацевт. Биомед. 66 , 271–277 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • Джи, Б. и др. . Разработка и валидация чувствительного и быстрого метода УЭЖХ–МС/МС для одновременного определения семи биологически активных соединений в плазме крыс после перорального приема отвара гуйчжи-ганцао. J.Pharmaceut.Biomed. 66 , 23–32 (2017).

    Артикул Google ученый

  • Крайхенбюль, С., Хаслер Ф. и Крапф Р. Анализ и фармакокинетика глицирризиновой кислоты и глицирретиновой кислоты у людей и экспериментальных животных. Стероиды 59 , 121–126 (1994).

    Артикул Google ученый

  • Акао, Т. и др. . Кишечный бактериальный гидролиз необходим для всасывания 18-бета-глицирретиновой кислоты после перорального введения глицирризина крысам. Дж. Фарм Фармакол. 46 (2), 135–142 (1994).

    КАС Статья Google ученый

  • Лей, Ю. и др. . Повышенная пероральная биодоступность глицирретиновой кислоты за счет состава нанокристаллов. Делив наркотиков. & Перев. Рез. 6 , 519–525 (2016).

    КАС Статья Google ученый

  • Вентилятор, Ю.Ю. и др. . Анализ биоактивных компонентов и фармакокинетическое исследование взаимодействия между травами в традиционной китайской патентованной медицине Tongmai Yangxin Pill. Дж. Фармасьют Биомед. 120 , 364–373 (2016).

    КАС Статья Google ученый

  • Ван, С. Н. и др. . Сравнительная фармакокинетика четырех биологически активных ингредиентов после введения экстракта пары трав Ramulus Cinnamomi–Radix Glycyrrhizae, экстракта Ramulus Cinnamomi и экстракта Radix Glycyrrhizae. Биомед. Хроматогр. 30 , 1270–1277 (2016).

    КАС Статья Google ученый

  • Ши Л. и др. . Изучение взаимодействий между травами и травами: потенциальный ослабленный механизм токсичности при комбинированном использовании корней солодки (Gancao) и корней софоры желтоватой (Kushen). Ж. Этнофармакол. 165 , 243–250 (2015).

    КАС Статья Google ученый

  • Цуй, Ю. и др. . Одновременное определение пяти биоактивных компонентов Gancao в плазме крыс с помощью УВЭЖХ-МС/МС и его применение для сравнительного фармакокинетического исследования несовместимой пары трав Gansui-Gancao и Gansuibanxia Decoction. Дж. Фармацевт. Биомед. 159 , 318–325 (2018).

    КАС Статья Google ученый

  • Ван Ю. и др. . Фармакокинетические сравнения различных комбинаций Shaoyao-Gancao-Decoction у крыс: одновременное определение часто активных компонентов с помощью ВЭЖХ-МС/МС. J. Хроматогра. B 932 , 76–87 (2013).

    КАС Статья Google ученый

  • Сюй, К.Н. и др. . Фармакокинетические сравнения двух различных комбинаций отвара Shaoyao-Gancao у крыс: конкурирующие механизмы между пеонифлорином и глицирретиновой кислотой. Ж. Этнофармакол. 149 , 443–452 (2013).

    КАС Статья Google ученый

  • Чжоу Б. и др. . Влияние совместимости обработанного корня Aconiti Kusnezoffii на фармакокинетику четырех компонентов Glycyrrhiza uralensis Fisch. Ж.Этнофармакол. 169 , 1–7 (2015).

    КАС Статья Google ученый

  • Sun, Y.M. и др. . Влияние пеонифлорина на фармакокинетику глицирризиновой кислоты и глицирретиновой кислоты у крыс. Лекарственное растение 3 , 29–32 (2012).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Google ученый

  • Донг, Ю. Л. и др. .Исследование кишечной проницаемости глицирретиновой кислоты в многокомпонентной среде. Chin Tradit Herbal Drugs 48 , 3396–3400 (2017).

    Google ученый

  • Набекура, Т., Ямаки, Т., Уэно, К. и Китагава, С. Ингибирование P-гликопротеина и белка множественной лекарственной устойчивости 1 диетическими фитохимическими веществами. Рак Химия. Фармакол. 62 , 867–873 (2008).

    КАС Статья Google ученый

  • Цю, В., Jiang, X.H., Liu, C.X., Ju, Y. & Jin, J.X. Влияние берберина на фармакокинетику субстратов CYP3A и P-gp. Фитотерм. Рез. 23 (11), 1553–1558 (2009).

    КАС Статья Google ученый

  • Бансал Т., Мишра Г., Джагги М., Хар Р. К. и Талегаонкар С. Влияние ингибитора Р-гликопротеина верапамила на пероральную биодоступность и фармакокинетику иринотекана у крыс. евро.Дж. Фарм. науч. 36 (4–5), 580–590 (2009).

    КАС Статья Google ученый

  • Wang, Y., Cao, J. & Zeng, S. Участие P-гликопротеина в регулировании клеточных уровней флавонолов гинкго: кверцетин, кемпферол и изорамнетин. Фарм. Фармакол. 57 (6), 751–758 (2005).

    КАС Статья Google ученый

  • Ромити, Н., Трамонти Г., Донати А. и Кьели Э. Влияние виноградного фруктового сока на полипептидный переносчик Р-гликопротеина в клеточной линии проксимальных канальцев человека HK-2. Науки о жизни. 76 , 293–302 (2004).

    КАС Статья Google ученый

  • Фармакологическая активность глицирризиновой кислоты («Глицирризин») и глицирретиновой кислоты

    2.1 Анти рак

    За последние несколько лет было сообщено о нескольких открытиях, касающихся противораковых свойств глицирризиновой кислоты.Ван и др. сообщили об активности 1 in vitro против клеточной линии рака желудка BCG-823. Сапонин был способен предотвращать пролиферацию, адгезию и миграцию клеток при дозе 40 мкМ, и они также наблюдали значительное снижение экспрессии β-катенина, Bcl-2, CyclinD1 и сурвивина [9].

    Чтобы оценить важность углеводного фрагмента в противораковых свойствах 1 , Yang et al. синтезировали два моноглюкуронида из 1 с помощью глюкуронидазы из Aspergillus sp.(Схема 1). Авторы сообщили, что полученный 18α-моноглюкуронид ( 5 ) был более эффективен против линий раковых клеток HepG2, HeLa и A549 (значения IC 50 : 6,67, 7,43 и 15,76 мкМ соответственно), чем 18 β -моноглюкуронид. ( 3 ), 1, и 18 α -глицирризиновая кислота ( 4 ). Моноглюкуронид 3 также был лучшим ингибитором рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) с IC 50 0,028 мкМ.Моделирование молекулярного докинга показывает, что 3 также способен связываться с EGFR, предполагая, что противораковые свойства этого глюкуронида связаны с ингибированием EGFR [10]. Схема 1

    Синтез 18 α -эпимеров глицирризиновой кислоты et al., чтобы выяснить механизм противораковой активности 1 в отношении клеточных линий аденокарциномы легкого A549, оценили экспрессию нескольких ферментов в модели in vitro и обнаружили, что противораковая активность 1 в отношении этой раковой клетки линия может быть, по мнению авторов, связана с ингибированием тромбоксансинтазы 1 .Такие же результаты были также получены на мышиной модели in vivo с использованием вестерн-блоттинга [11].

    Ингибирование High-Mobility Group Box 1 (HMGB1), белка, который действует вне клеточной среды как провоспалительный цитокин, также может быть связано с противоопухолевыми свойствами 1 . Смоларчик и др. сообщили, что при использовании в модели опухоли in vivo использование 1 ингибировало рост и пролиферацию клеток у мышей. Авторы пришли к выводу, что ингибирование роста клеток, вероятно, связано с ингибированием HMGB1 1 во внеклеточной среде [12].

    2.2 Противовоспалительное

    Wang et al. определили, что 1 способен ослаблять уровни фактора некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкина 1β (IL-1β) и активировать сигнальный путь HMGB1/NFκB (ядерный фактор-kB) в гиппокампе новорожденных. крысы после воздействия изофлюрана (наркотик для общей анестезии). Более того, лечение 1 также предотвращало дефицит пространственной памяти, связанный с изофлураном [13].

    Используя модель травмы поджелудочной железы у самцов крыс Wistar, Xiang et al.сообщили, что лечение 1 через 15 минут после нанесения травмы привело к более низким уровням в сыворотке HMGB-1, TNF-α и IL-6 по сравнению с контрольной группой. Лечение сапонином также увеличивало семидневную выживаемость животных в этой экспериментальной модели.

    Чжан и др. сообщили, что 1 оказывает нейропротекторное действие на постишемический мозг у мышей посредством пути HMGB1-TLR4-IL-17A [14].

    Глицирризиновая кислота ( 1 ) и флавоноиды солодки, протестированные in vitro в отдельных группах, были обнаружены Zhao et al.для модуляции секреции ряда цитокинов макрофагами (клетки RAW 264.7), индуцированной липополисахаридами (ЛПС) [15]. Фу и др. сообщили, что 1 продемонстрировал свою противовоспалительную активность в стимулированных LPS клетках RAW 264.7, разрушая липидные рафты и ингибируя транслокацию Toll-подобного рецептора-4 (TLR-4) в эти рафты [16].

    Ван и др. сообщили, что 1 был способен уменьшить вызванный ксилолом, каррагинаном и уксусной кислотой отек лапы крысы и ноцицепцию, вызванную формалином и уксусной кислотой, но не оказал никакого влияния в тесте на горячей пластине.Авторы также наблюдали снижение уровней TNF-α, IL-6, индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) и циклооксигеназы-2 (COX-2) [17].

    Изучение эффектов 1 на модели субарахноидальной геморрагии (САК) у крыс, Chang et al. сообщили, что сапонин оказывает противовоспалительное действие, уменьшая вызванный SAH вазоспазм, в основном за счет ослабления гамма-рецептора, активирующего пролиферацию пероксисом (PPAR-γ) [18]. Та же исследовательская группа сообщила, что в той же модели SAH лечение 1 также способно ослаблять сверхкратковременную экспрессию Toll-подобных рецепторов (TLR) 2 и 4 [19].

    Сапонин также прошел несколько клинических испытаний в отношении его противовоспалительной активности. Сяо и др. провели рандомизированное исследование с участием 39 детей с пурпурой Шенлейна-Геноха (ПШГ) с целью проверки функций регуляторных Т-клеток (Treg) и клеток Th27 в периферической крови этих пациентов. Группа, получавшая 1 , имела значительно разные уровни интерлейкина-17 (ИЛ-17) в сыворотке после лечения, но не отличалась в уровнях трансформирующего фактора роста-бета (ТФР-β) и интерлейкина-10 (ИЛ-10) в сыворотке после лечения. лечение.Авторы пришли к выводу, что 1 способен снижать функцию Th27 без заметного влияния на функцию Treg [20].

    Глицирризиновая кислота также была испытана у пациентов с хронической крапивницей. Восемьдесят четыре пациента с этим заболеванием были рандомизированы в две группы: одна с 1 (таблетки для приема внутрь по 50 мг три раза в день), а другая с левоцетиризином (противоаллергическим препаратом). Оба соединения вводили в течение четырехнедельного периода. Авторы пришли к выводу, что 1 превосходит левоцетиризин и может использоваться для лечения хронической крапивницы [21].Стоит отметить, что 1 не имеет пероральной биодоступности, гидролизуется с образованием глицирретиновой кислоты ( 2 ) перед абсорбцией [1]. Следовательно, наблюдаемая фармакологическая активность, вероятно, обусловлена ​​известной противовоспалительной активностью 2 (см. раздел 3 этой главы), а не 1 .

    2.3 Гепатопротекторные эффекты

    Изоглицирризинат магния, магниевая соль 18 α -глицирризиновой кислоты ( 4 ), была обнаружена Luo et al.быть эффективным средством против гепатита Е с тяжелой желтухой во время клинических испытаний с участием 78 пациентов. Пациенты получали внутривенную инъекцию 150 мг магния один раз в день в течение 6 недель [22].

    Чжан и др. провели клиническое исследование с участием 84 пациентов с раком пищеварительного тракта с целью проверки гепатопротекторной активности 1 при стандартной химиотерапии рака. Авторы заметили, что группа, проходящая химиотерапию и получавшая сапонин (160 мг внутривенно.v. один раз в день) показали значительно более низкие уровни печеночных трансаминаз и повышенные уровни нейтрофилов, гранулоцитов и лейкоцитов по сравнению с контрольной группой (только стандартная химиотерапия) [23].

    Также при исследовании гепатопротекторной активности 1 Hsiang et al. исследовали экспрессию генов клеток HepG2, обработанных in vitro независимо друг от друга 1 , силимарином и урсодезоксихолевой кислотой, природными продуктами, также известными своими гепатопротекторными свойствами.Авторы пришли к выводу, что соединения ингибируют активность NF-κB дозозависимым образом и что эти соединения регулируют экспрессию генов, связанных с окислительным стрессом и апоптозом в этих клетках [24].

    Мэн и др. провели метаанализ 12 рандомизированных клинических исследований относительно гепатопротекторной активности 1 у пациентов с алкогольной болезнью печени. Их анализ показал, что в этих испытаниях уровни аланиновой и аспартатаминотрансфераз, а также γ-глутарилтранспептидазы были ниже, чем в контрольных группах после лечения сапонином [25].

    Во время исследования пациентов с хроническим гепатитом В Yin et al. обнаружили, что трехнедельное лечение 1 не снижало экспрессию воспалительного цитокина IL-17 и антинуклеарных антител (ANA) у пациентов, получавших лечение, по сравнению с контрольной группой [26].

    Лечение хронического гепатита В изоглицирризинатом магния или 1 сравнивали в клиническом испытании, о котором сообщили Cai et al. В исследовании приняли участие 64 пациента, которые были разделены на две группы (одна группа получала внутривенное лечение солью магния, а другая — сапонином, т.v., один раз в день в течение 4 недель). В обоих случаях у пациентов улучшилась функция печени, но авторы не обнаружили статистических различий между обоими видами лечения [27].

    Дин и др. исследовали влияние 18 α -глицирризиновой кислоты ( 4 ) на крыс с индуцированным четыреххлористым углеродом (CCl 4 ) фиброзом печени. Было обнаружено, что обработка 4 повышает активность ферментов глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы, которые снижают перекисное окисление липидов и уровни малонодиальдегида и гидроксиноненаля в печени, защищая ее от повреждения, вызванного альдегидами [28].

    Ван и др. обнаружили, что обработка клеток HepG2 препаратом 1 вызывала увеличение как мРНК CYP3A, так и уровней белка. Ген CYP3A кодирует монооксигеназы, ответственные за метаболизм лекарственных средств и биосинтез стероидов [29]. Авторы также обнаружили, что индукция CYP3A опосредована активацией рецептора Pregnane X (PXR), что приводит к индукции экспрессии CYP3A11 и ингибированию CYP7A1 [30].

    Гепатопротекторный эффект 1 также был изучен с использованием HL-7702 (линия нормальных клеток печени человека) при повреждении, вызванном ацетаминофеном.Согласно отчету Chen et al., 1 , ликвиртин и изоликвиртигенин (два полифенола, также обнаруженные в экстракте корня солодки) были эффективны в качестве гепатозащитных средств против повреждений, вызванных ацетаминофеном [31].

    Gwak et al., исследуя роль HMGB-1 в апоптозе гепатоцитов, обнаружили, что 1 , известный как ингибитор HMGB-1, способен предотвращать индуцированный HMGB-1 апоптоз, высвобождение цитохрома C и активацию p38. в клеточной линии Huh-BAT (гепатоцеллюлярная карцинома человека, трансфицированная переносчиком желчных кислот) [32].

    2.4 Противовирусное

    Глицирризиновая кислота ( 1 ) известна в литературе как противовирусное средство против клинически значимых вирусов, таких как ВИЧ и SARS-коронавирус [3, 6]. Дуан и др. сообщили, что 1 активен в отношении вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), важного в ветеринарии и в свиноводстве. Сапонин был способен ингибировать в основном стадию проникновения вирусного цикла [33].

    Изучая известную активность сапонина против ВИЧ, Li et al.обнаружили, что 1 среди 27 соединений, выделенных из экстракта солодки, имеет высокую константу связывания для R15K, консервативной основной последовательности в области петли V3 gp120. В этой области, по мнению авторов, происходит связывание гликофосфолипидов, что приводит к проникновению вируса в клетку-хозяин, что может указывать на то, что сапонин обладает анти-ВИЧ-активностью, ингибируя стадию проникновения вируса [34].

    Используя модель клеток Huh7, инфицированных вирусом гепатита С (HCV), Matsumoto et al.сообщили, что 1 ингибирует высвобождение частиц ВГС. Подавление стадий проникновения и репродукции вируса не наблюдалось [35]. Ashfaq et al., также исследуя анти-HCV-активность сапонина, сообщили, что обработка клеток печени, инфицированных HCV, приводила к подавлению корового гена HCV 3a как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Совместное введение 1 с интерфероном альфа-3а вызывало синергетический эффект [36].

    2.5 Другие виды деятельности

    Сяо и Чжоу сообщили, что 1 снижает перепроизводство муцина 5 AC, индуцированного эластазой нейтрофилов человека (MUC5AC), в культуре клеток бронхиального эпителия человека (16HBE) [37].

    Взаимодействие 1 с человеческим гемоглобином (Hb) изучали Sil et al. Авторы сообщили, что взаимодействие между сапонином и белком уменьшает Hb-опосредованное окислительное повреждение, не влияя на кислородсвязывающие свойства Hb [38].

    Антитромбиновая активность 1 была известна еще с 1997 г. [39]. Было обнаружено, что глицирризиновая кислота является слабым ингибитором тромбина in vitro и in vivo, но, в отличие от других антитромбиновых агентов, сапонин действует как аллостерический ингибитор [40].Однако глицирретиновая кислота ( 2 ) не обладает активностью, ингибирующей тромбин, что указывает на то, что углеводная часть сапонина важна для взаимодействия с аллостерическим сайтом. Имея в виду эти результаты, Paula et al. синтезировали некоторые производные, стремясь упростить углеводный каркас. Из всех синтезированных соединений полуфталат 6 (схема 2) проявлял лучшую антитромбиновую активность in vitro в отношении тромбина и увеличивал тромбиновое время, указывая на то, что фрагмент карбоновой кислоты, присутствующий в сапонине (и во фталате), важен для распознавания в аллостерическом сайте [41].Схема 2

    Синтез глицирретиновой кислоты 3- O -гемифталат

    Изучение способности 1 поглощать свободные радикалы, Imai et al.

    Leave a Reply

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.