2 Кафедра дерматологии, Университет Дунареа де Жос, медицинский факультет, 800008 Галац, Румыния Никута Манолаке
4 Кафедра дерматологии, Университет Дунареа де Жос, медицинский факультет, 800008 Галац, Румыния
Ионела Лакрамиоара Сербан
1 Кафедра физиологии, «Григор Т.Медицинский и фармацевтический университет Попа, 700115 Яссы, Румыния
1 Кафедра физиологии, Медицинский и фармацевтический университет им. Григория Т. Попа, 700115 Яссы, Румыния
2 Кафедра дерматологии, Григор Т. Медицинский и фармацевтический университет Попа, 700115 Яссы, Румыния
3 Кафедра офтальмологии, Медицинский и фармацевтический университет им. Григория Т. Попа, 700115 Яссы, Румыния
4 Кафедра дерматологии, Дунарея де Жос Университет, медицинский факультет, 800008 Галац, Румыния
Корреспонденция на : Профессор Дачиана Браништяну, отделение дерматологии, «Григор Т.Университет медицины и фармации Попа, 16 University Street, 700115 Яссы, Румыния, E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 20 августа 2018 г.; Принято 17 декабря 2018 г.
Эта статья была процитирована другими статьями в PMC. Abstract
Процесс синтеза и распределения меланина называется меланогенезом, в основе которого лежат меланоциты, присутствующие среди базальных клеток эпидермиса. Пигменты, образующиеся в меланосомах меланоцитов, затем запасаются в базальном слое эпидермальных клеток, а также в дермальных макрофагах, которые становятся меланофорами.С эмбриологической точки зрения меланоциты происходят из меланобластов нервного гребня, откуда они мигрируют в течение первых месяцев жизни в кожу, глаза, улитку, кости, периферическую нервную систему, сердце и жировую ткань. Меланиновые пигменты, эумеланин и феомеланин, являются конечным продуктом сложных биохимических реакций, происходящих из аминокислоты L-тирозина. Меланин играет важную роль в гомеостазе кожи благодаря фотозащите, которую он предлагает от вредного воздействия ультрафиолетового излучения.Меланин поглощает и/или отражает ультрафиолетовое излучение, но также участвует в процессе нейтрализации свободных радикалов и активных форм кислорода. Пигментогенез является зависимым от кислорода процессом и контролируется внутренними факторами (генетическими и гормональными), а также внешними факторами (ультрафиолетовое излучение). Меланогенез стимулируется стимулирующим меланоцитарным гормоном, адренокортикотропным гормоном, эстрогенами и прогестероном. Целью настоящего обзора является краткое изложение последних данных о физиологии меланогенеза.
Ключевые слова: меланин, кожа, физиология, меланогенез, ультрафиолетовое излучение название меланогенеза (1). За синтез мелановых пигментов отвечают меланоциты, нейроэктодермические дендритные клетки (2). Меланоциты составляют 8% клеток эпидермиса и имеют в качестве предшественников меланобласты, клетки, происходящие из клеток нервного гребня с эмбриологической точки зрения (3).Одновременно с закрытием нервной трубки (4) меланобласты мигрируют в различные области организма, такие как кожа, периферическая нервная система, хрящи, кости, сосудистая оболочка глаза, жировая ткань и улитка (5). В нижнем слое эпидермиса и на уровне волосяного фолликула меланобласты превращаются в меланоциты и становятся способными выполнять свою основную функцию — секретировать меланин (6). Процесс миграции, пролиферации и дифференцировки меланоцитов происходит под влиянием клеток нервной трубки, клеток эктодермы и кератиноцитов, а также под влиянием семейства гликопротеинов WNT, эндотелина 3 и фактора стволовых клеток (7).
Благодаря своей специфической химической структуре молекула меланина играет роль в пигментации кожи и обеспечивает фотозащиту организма, поглощая солнечное ультрафиолетовое излучение. Цвет кожи, волос и глаз определяется мелановыми пигментами, а точнее соотношением между двумя типами меланового пигмента. Количество меланового пигмента придает коже цвет от белого (отсутствие меланового пигмента) до черного (повышенная плотность меланина), а соотношение эумеланин-феомеланин определяет различия в пигментации кожи человека (8).Если количество феомеланина, продуцируемого эпидермальными меланоцитами, выше по сравнению с количеством эумеланина, то кожа имеет более светлый цвет и более восприимчива к солнечным ожогам (9). В коже, содержащей большее количество феомеланина, после воздействия солнечного ультрафиолетового излучения вырабатывается большее количество активных форм кислорода, что приводит к клеточному повреждению и инициированию канцерогенного процесса (10–12).
Количество синтезируемого меланина меланоцитов генетически детерминировано и зависит от этнической принадлежности, но также находится под влиянием внутренних и внешних факторов.В категорию внутренних факторов входят молекулы, секретируемые окружающими меланоциты клетками: кератиноцитами, фибробластами, воспалительными клетками и эндокринными клетками (13). Ультрафиолетовое излучение и различные химические продукты представляют собой внешние факторы, которые накладывают свой отпечаток на меланогенез. Реакция кожи на различные внутренние и внешние факторы находится под контролем кожной нейроэндокринной системы (14).
2. Меланоциты
С уровня нервного гребня меланоциты мигрируют в различные области человеческого тела для выполнения своей основной функции – синтеза меланина.Меланобласты, недифференцированные клетки, достигают не только кожи и волосяного фолликула, но и глаз, мозговых оболочек, сердца и улитки, где трансформируются в меланоциты.
Синтез и хранение меланина происходит в клеточных органеллах, характерных для меланоцитов, называемых меланосомами. Уникальные клеточные органеллы, родственные лизосомам, меланосомы, происходят из молодых эндосом. Меланосомы имеют различную структуру и функцию в зависимости от синтезированного меланового пигмента. В то время как в околоядерной области меланоцитов меланосомы незрелые и непигментированные.Когда они мигрируют к дендритам, они претерпевают ряд конформационных изменений и становятся зрелыми, пигментированными и непрозрачными для электронов (15).
Меланосомы присутствуют у людей с черной кожей, меланоциты крупнее, удлиненнее и многочисленнее, а кератиноциты деградируют медленнее.
В эпидермисе меланоциты встраиваются в кератиноциты из-за их длинных и тонких отростков. Меланоцит окружен 36 кератиноцитами, с которыми он образует эпидермальную единицу, активность которой регулируется паракринно.С одной стороны, на количество синтезируемых мелановых пигментов на уровне меланоцитов влияет (стимулируется или ингибируется) ряд факторов, секретируемых кератиноцитами, а с другой стороны, меланоциты выделяют ряд веществ, действующих на кератиноциты (16). ). Через расширения меланосомы меланоцитов переносятся на окружающие кератиноциты (17), где они равномерно распределяются, чтобы обеспечить однородную пигментацию и создать экран, покрывающий ядра кератиноцитов (18).Перенос зрелых меланосом в кератиноциты происходит при увеличении рН внеклеточной среды с 5,0 до 6,8 (19). Кератиноциты захватывают меланосомы посредством процесса фагоцитоза (20), процесса, зависящего от ультрафиолетового излучения и регулируемого α-меланоцитарным гормоном (α-МСГ) (21).
С помощью α-МСГ после воздействия солнечного ультрафиолетового излучения стимулируется пигментация кожи за счет увеличения синтеза меланина, а также пролиферации и распространения эпидемических меланоцитов (16).Более того, на количество дендритов меланоцитов, а также на скорость переноса меланосом на уровне эпидермального единства влияет воздействие солнечного ультрафиолетового излучения (16). Благодаря такому расположению меланин защищает ядерную ДНК от ультрафиолетовых лучей солнечного света (22). Процесс пигментации повышает устойчивость кожи человека к солнечным ожогам (22).
Важную роль в дифференцировке, пролиферации и морфологии меланоцитов играет глутаматный путь путем активации эпидермальных глутаматных рецепторов (23).На уровне меланоцитов и кератиноцитов описаны глутаматные рецепторы (24).
Различия в пигментации кожи человека появляются из-за различного количества меланосом в кератиноцитах (15). Для выполнения основной функции продолжительность жизни и устойчивость меланоцитов должны быть высокими. На уровне волосяного фолликула синтез меланового пигмента происходит в фолликулярной единице, состоящей из фолликулярных меланоцитов, кератиноцитов и папиллярных фибробластов дермы (22), которая по сравнению с эпидермальной единицей больше.Синтез мелановых пигментов в коже является непрерывным процессом на уровне волосяного фолликула. С другой стороны, меланогенез активен только во время анагенной (ростовой) фазы волос (24) и гораздо более чувствителен к процессу старения (25). Функционирование эпидермального единства не зависит от фолликулярного единства. Меланоциты волосяного фолликула имеют более крупные и разветвленные меланосомы, а аппарат Гольджи и шероховатый эндоплазматический ретикулум лучше развиты (26).
Меланоциты могут мигрировать в эпидермис, дерму или дермо-эпидермальные соединения и образовывать клеточные гнезда.Под воздействием факторов окружающей среды они превращаются в невусы, порождая доброкачественные опухоли, называемые невусами. Меланома возникает в результате дисплазии нервных клеток (27).
Помимо эпидермиса и волосяного фолликула, меланобласты мигрируют на уровень конъюнктивы глаза и во все области сосудистой оболочки глаза (радужка, цилиарное тело и сосудистая оболочка) и трансформируются в меланоциты. Точно неизвестно, какова роль конъюнктивных меланоцитов, но меланоциты, присутствующие в увеальной области, обеспечивают защиту от некоторых заболеваний глаз, которые могут привести к слепоте.В отличие от кожи, цвет радужной оболочки остается стабильным после пребывания на солнце.
Меланоциты также присутствуют в органах человеческого тела, не подвергающихся воздействию солнца, где они выполняют другие функции, помимо фотозащиты. Меланоциты на уровне улитки играют важную роль в слухе и балансе (28), участвуя в синтезе эндолимфы. Меланоциты в головном мозге выполняют нейроэндокринную функцию и обеспечивают защиту от процессов окисления (29), а их присутствие на уровне сердца участвует в правильном механическом функционировании клапанов (30), а также в предсердной аритмии (31).
3. Рецептор меланокортина 1
Количество синтезируемого меланина регулируется рецептором меланокортина 1 (MC1R), расположенным на уровне мембраны меланоцитов. MC1R принадлежит к подгруппе рецепторов класса А, связанных с G-белком. Связывание внеклеточных лигандов с этим рецептором приводит к ряду каскадных реакций, которые начинаются с активности Gs-белка. Белок Gs представляет семь трансмембранных доменов, и когда он активируется, он стимулирует ферментативную активность аденилатциклазы.Аденилатциклаза превращает внутриклеточный АТФ в AMPc. Увеличение внутрицитоплазматического AMPc влияет на увеличение продукции меланина, а также на повышение устойчивости меланоцитов к апоптозу и улучшение геномной стабильности меланоцитов.
Синтез эумеланина стимулируется α-МСГ и адренокортикотропным гормоном (АКТГ), двумя агонистами MC1R, а продукция эумеланина и феомеланина регулируется α-МСГ посредством MC1R (32). α-МСГ и АКТГ имеют в качестве общего предшественника проопиомеланокортин (РОМС), синтетический белок гипофиза.Более того, α-МСГ также образуется в эпидермальных кератиноцитах, продукция которых регулируется локально, паракринно (33). Гиперпигментация кожи лица и шеи, известная как меланодермия, возникает у женщин фертильного возраста и чаще всего возникает в результате беременности и пребывания на солнце из-за повышенной выработки меланина и меланоцитоза (34).
Гормональные изменения во время беременности (повышение уровня α- и β-МСГ, эстрогена, прогестерона и β-эндорфина в плазме) стимулируют выработку меланоцитами избыточного меланина (35).Кроме того, липиды плаценты человека усиливают активность тирозиназы и увеличивают синтез меланина. Во время беременности плазматические уровни АКТГ и кортизола повышены. CRH стимулирует плацентарную продукцию α-MSH и POMC. Через 3 дня после родов уровень РОМС в плазме возвращается к норме (36,37).
Солнечное ультрафиолетовое излучение стимулирует генную экспрессию ПОМС и увеличивает продукцию ПОМС. Увеличение количества α-МСГ или АКТГ активирует MC1R, что приводит к увеличению внутриклеточного количества AMPc, и синтез феомеланина заменяется синтезом эумеланина.Воздействие солнечного ультрафиолетового излучения определяет на уровне кожи два типа реакции: с одной стороны, немедленную пигментацию, которая появляется через пару минут после пребывания на солнце и исчезает через 6–8 ч и является результатом окисление ранее существовавшего меланина или его предшественников, и, с другой стороны, отсроченная пигментация, которая появляется через 48–72 часа после пребывания на солнце и является стойкой, являясь результатом образования нового количества меланина.Меланогенез также стимулируется рядом цитокинов с паракринным эффектом, таких как простагландины E2 и D2 (37,38), фактор стволовых клеток (39), эндотелин-1 (40), оксид азота (41), гистамин (42), Cu- и As-ионы и ингибируется тиамином, гидрохиноном, аскорбиновой кислотой, Ag- и Hg-ионами.
4. Синтез мелановых пигментов
Необходимые для синтеза катехоламинов аминокислота тирозин и ее гидроксилированный продукт ДОФА представляют собой отправную точку биосинтеза мелановых пигментов.Raper и Mason в период между 1930 и 1940 годами первыми установили путь биосинтеза эумеланина (43). Меланин образуется в результате каскадных реакций, катализируемых ферментами. Мелановый пигмент желтовато-красноватого цвета, феомеланин, полимер, растворимый в щелочных растворах, образуется в результате окислительной полимеризации цистеинилдопы (образуется в результате конденсации аминокислоты цистеина с допахиноном). Эумеланин, нерастворимый в щелочных растворах полимер от коричневатого до черноватого цвета, образуется в результате окислительной полимеризации 5,6-дигидроксииндола.Гидроксилирование L-тирозина в L-ДОФА катализируется тирозиназой (TYR) и серией белков, родственных тирозиназе (44).
Тирозиназа, мембранный белок 3-го типа (45), является незаменимым ферментом меланогенеза. Он расположен только в мембране меланосом, клеточных органеллах, специфичных для меланоцитов. Фермент синтезируется на уровне эндоплазматического ретикулума, а затем упаковывается в пузыри аппарата Гольджи, откуда транспортируется в меланосомы, место синтеза меланина.Активность тирозиназы коррелирует со степенью продукции меланина. Синтез меланосом и активность тирозиназы стимулируется L-тирозином (46). Концентрация L-тирозина и L-ДОФА регулирует гомеостаз меланогенной системы, а меланоциты координируют эту систему не только локально, но и в целом (47).
Азелаиновая кислота ингибирует синтез ДНК и митохондриальных ферментов, влияет на тирозиназу и снижает выработку свободных радикалов, способствующих гиперпигментации кожи (48).Из-за прямого цитотоксического действия на аномальные меланоциты азелаиновая кислота полезна при лечении гиперпигментации (не влияет на нормальную пигментацию кожи и не вызывает депигментации).
В мозгу человека нейромеланин образуется в результате окисления дофамина в допахинон, реакции, катализируемой тирозиназой. Образование избытка допахинона приводит к нервному расстройству и смерти (49). Таким образом, предполагается участие тирозиназы в нейродегенерации, связанной с болезнью Паркинсона (50) и хореей Гентингтона (51, 52).Вместе с тирозиназой в превращении тирозина в мелановые пигменты принимают участие еще 2 белка, называемых дофахрометаутомеразой, представленных белком 1, родственным тирозину (TRP-1), и белком 2, родственным тирозину (TRP-2). . Как и тирозиназа, TRP-1 и TRP-2 находятся в меланосомах. Роль этих белков имеет решающее значение, поскольку они катализируют реакции, в результате которых образуется эумеланин. TRP-1 ведет себя как пероксидаза и обеспечивает защиту от окислительного стресса (13,53).
5. Заключение
Более точное знание физиологии меланогенеза помогает понять патофизиологические механизмы дерматологических заболеваний, возникающих в результате меланогенеза.
Финансирование
Финансирование не получено.
Наличие данных и материалов
Неприменимо.
Вклад авторов
MAM, DB и ILS внесли вклад в разработку концепции и дизайна исследования, а DNS, DCB, GS и NM внесли свой вклад в анализ данных и критическую интерпретацию.MAM и DB отвечали за составление рукописи и ее критический пересмотр важного интеллектуального содержания, в то время как DNS, DCB, GS, NM и ILS сосредоточились на пересмотре конкретных аспектов важного интеллектуального содержания. Все авторы заявляют о своем окончательном одобрении версии, которая будет опубликована, и о своем согласии нести ответственность за все аспекты работы, обеспечивая надлежащее расследование и решение вопросов, связанных с точностью или достоверностью любой части работы.
Одобрение этики и согласие на участие
Неприменимо.
Согласие пациента на публикацию
Неприменимо.
Конкурирующие интересы
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Ссылки
1. Bonaventure J, Domingues MJ, Laru L. Клеточные и молекулярные механизмы, контролирующие миграцию меланоцитов и клеток меланомы. Пигментно-клеточная меланома Res. 2013;26:316–325. doi: 10.1111/pcmr.12080. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]2.Шадендорф Д., Фишер Д.Е., Гарб С., Гершенвальд Дж.Е., Гроб Дж.Дж., Халперн А., Херлин М., Маркетти М.А., МакАртур Г., Рибас А. и другие. Меланома. Праймеры Nat Rev Dis. 2015;1:15003. doi: 10.1038/nrdp.2015.3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3. Свидерская Е.В., Хилл С.П., Балачандар Д., Барш Г.С., Беннетт Д.С. Сигнальный белок агути и другие факторы, модулирующие дифференцировку и пролиферацию бессмертных меланобластов. Дев Дин. 2001; 221:373–379. doi: 10.1002/dvdy.1153. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4. Панцелла Л., Эбато А., Наполитано А., Койке К.Поздние стадии меланогенеза: изучение химических аспектов и возможностей применения. Int J Mol Sci. 2018;19:E1753–E1769. doi: 10.3390/ijms153. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5. Бастиан БК. Молекулярная патология меланомы: комплексная таксономия меланоцитарной неоплазии. Анну Рев Патол. 2014;9:239–271. doi: 10.1146/annurev-pathol-012513-104658. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]6. Цихорек М., Вахульская М., Стасевич А., Тыминьская А.Меланоциты кожи: биология и развитие. Постерий Дерматол Алергол. 2013;30:30–41. doi: 10.5114/pdia.2013.33376. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7. Костин Г.Э., Слух VJ. Пигментация кожи человека: Меланоциты модулируют цвет кожи в ответ на стресс. FASEB J. 2007; 21: 976–994. doi: 10.1096/fj.06-6649rev. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8. Лин Д.Ю., Фишер Д.Е. Биология меланоцитов и пигментация кожи. Природа. 2007; 445:843–850. doi: 10.1038/nature05660. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]9.Ву С., Хан Дж., Ладен Ф., Куреши А.А. Длительный ультрафиолетовый поток, другие потенциальные факторы риска и риск рака кожи: когортное исследование. Эпидемиологические биомаркеры рака Prev. 2014;23:1080–1089. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-13-0821. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]10. Окадзаки С., Фунасака Ю., Вакамацу К., Кавана С., Саеки Х. Влияние инфракрасного излучения А на фотостареющих безволосых мышей, несущих эумеланин и феомеланин в эпидермисе. J Дерматол. 2015;42:382–390. doi: 10.1111/1346-8138.12790.[PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Неагу М., Карунту С., Константин С., Бода Д., Зурак С., Спандидос Д.А., Цацакис А.М. Химически индуцированный канцерогенез кожи: обновления экспериментальных моделей (обзор) Oncol Rep. 2016; 35:2516–2528. doi: 10.3892/or.2016.4683. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]12. Лупу М., Карунту А., Карунту С., Папагеорге ЛМЛ, Илие М.А., Войкулеску В., Бода Д., Константин С., Танасе С., Сифаки М. и др. Нейроэндокринные факторы: недостающее звено в немеланомном раке кожи (обзор) Oncol Rep.2017; 38:1327–1340. doi: 10.3892/or.2017.5817. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]14. Сломински А.Т., Змиевски М.А., Скобовят С., Збитек Б., Сломински Р.М., Стекети Д.Д. Восприятие окружающей среды: Регуляция локального и глобального гомеостаза нейроэндокринной системой кожи. Adv Anat Embryol Cell Biol. 2012; 212:1–115. doi: 10.1007/978-3-642-19683-6_1. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]15. Вирадор В.М., Мюллер Дж., Ву С., Абдель-Малек З.А., Ю З.С., Ферранс В.Дж., Кобаяши Н., Вакамацу К., Ито С., Хаммер Дж.А. и др.Влияние α-меланоцитстимулирующего гормона и ультрафиолетового излучения на перенос меланосом в кератиноциты. FASEB J. 2002; 16: 105–107. doi: 10.1096/fj.01-0518fje. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Юань XH, Джин ZH. Паракринная регуляция меланогенеза. Бр Дж Дерматол. 2018; 178: 632–639. doi: 10.1111/bjd.16387. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Delevoye C. Перенос меланина: Кератиноциты больше, чем обжоры. Джей Инвест Дерматол. 2014; 134:877–879. doi: 10.1038/jid.2013.487. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Бреннер М., слушатель VJ. Защитная роль меланина от УФ-повреждений в коже человека. Фотохим Фотобиол. 2008; 84: 539–549. doi: 10.1111/j.1751-1097.2007.00226.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]19. Маркс М.С., Сибра М.С. Меланосома: мембранная динамика в черно-белом изображении. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001; 2: 738–748. doi: 10.1038/35096009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Бода Д. Целломика как интегративная омика для лечения рака. Карр Протеомика.2013;10:237–245. doi: 10.2174/1570164611310030006. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 22. Сломински А., Вортсман Дж., Плонка П.М., Шаллрейтер К.У., Паус Р., Тобин Д.Дж. Пигментация волосяных фолликулов. Джей Инвест Дерматол. 2005; 124:13–21. doi: 10.1111/j.0022-202X.2004.23528.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]23. Фишер М., Гланц Д., Урбацка М., Бжоска Т., Абельс С. Кератиноциты: источник передатчика L-глутамата в эпидермисе. Опыт Дерматол. 2009;18:1064–1066. doi: 10.1111/j.1600-0625.2009.00886.х. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Сломински А., Паус Р. Меланогенез связан с мышиным анагеном: к новым концепциям роли меланоцитов и регуляции меланогенеза в росте волос. Джей Инвест Дерматол. 1993;101:90С–97С. doi: 10.1111/1523-1747.ep12362991. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Тобин Д.Дж., Паус Р. Поседение: геронтобиология пигментной единицы волосяного фолликула. Опыт Геронтол. 2001; 36: 29–54. doi: 10.1016/S0531-5565(00)00210-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26.Pandiani C, Béranger GE, Leclerc J, Ballotti R, Bertolotto C. Сосредоточьтесь на особенностях меланомы кожи и сосудистой оболочки глаза. Гены Дев. 2017; 31: 724–743. doi: 10.1101/gad.296962.117. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]27. Маринеску С.А., Тату А.Л., Михай И.Р., Джуглеа К. Корреляции между клиникой, дерматоскопией и гистопатологией у женщины с двумя дерматофибромами — клинический случай. Ром Джей Морфол Эмбриол. 2016;57:323–326. [PubMed] [Google Scholar] 28. Такеда К., Такахаши Н.Х., Шибахара С. Нейроэндокринные функции меланоцитов: Помимо производства меланина в глубине кожи.Тохоку J Exp Med. 2007; 211:201–221. doi: 10.1620/tjem.211.201. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Zecca L, Casella L, Albertini A, Bellei C, Zucca FA, Engelen M, Zadlo A, Szewczyk G, Zareba M, Sarna T. Нейромеланин может защищать от опосредованного железом окислительного повреждения в системе, моделирующей перегрузку железом при старении мозга и болезни Паркинсона. . Дж. Нейрохим. 2008; 106: 1866–1875. [PubMed] [Google Scholar] 30. Карнейро Ф., Круитхоф Б.П., Балани К., Агарвал А., Гауссин В., Кос Л. Взаимосвязь между меланоцитами, механическими свойствами и составом внеклеточного матрикса в сердечных клапанах мышей.Имплантаты J Long Term Eff Med. 2015;25:17–26. doi: 10.1615/JLongTermEffMedImplants.2015011748. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31. Левин М.Д., Лу М.М., Петренко Н.Б., Хокинс Б.Дж., Гупта Т.Х., Ланг Д., Бакли П.Т., Йохемс Дж., Лю Ф., Сперни С.Ф. и соавт. Меланоцитоподобные клетки в сердце и легочных венах способствуют триггерам предсердной аритмии. Джей Клин Инвест. 2009;119:3420–3436. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]32. Биван С., Хорнер А., Борд С., Айрленд Д., Компстон Дж. Колокализация глюкокортикоидных и минералокортикоидных рецепторов в костях человека.Джей Боун Шахтер Рез. 2001; 16: 1496–1504. doi: 10.1359/jbmr.2001.16.8.1496. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33. Абдель-Малек З., Своуп В.Б., Судзуки И., Аккали С., Харригер М.Д., Бойс С.Т., Урабе К., Слушание В.Дж. Митогенная и меланогенная стимуляция нормальных меланоцитов человека меланотропными пептидами. Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92: 1789–1793. doi: 10.1073/pnas.92.5.1789. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]34. Тату АЛ. Пигментация кожи и невусов при беременности. J Am Acad Дерматол.2012;66:AB148. [Google Академия] 35. Тату АЛ. Мелазма и беременность. Австралас Дж. Дерматол. 2011;53:37. [Google Академия] 36. Тату АЛ. Кожные рубцы и беременность. Австралас Дж. Дерматол. 2010;51:A48–A50. [Google Академия] 37. Тату АЛ. Дерматоскопические структурные изменения невусов во время беременности, связанные с локализацией. J Am Acad Дерматол. 2011;64:AB75. [Google Академия] 38. Nordlund JJ, Collins CE, Rheins LA. Простагландины E2 и D2, но не MSH, стимулируют пролиферацию пигментных клеток в ушном эпидермисе мышей DBA/2.Джей Инвест Дерматол. 1986; 86: 433–437. doi: 10.1111/1523-1747.ep12285717. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 39. Судзуки И., Коне Р.Д., Им С., Нордлунд Дж., Абдель-Малек З.А. Связывание меланотропных гормонов с меланокортиновым рецептором MC1R на меланоцитах человека стимулирует пролиферацию и меланогенез. Эндокринология. 1996; 137:1627–1633. doi: 10.1210/endo.137.5.8612494. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]40. Имокава Г., Миягиши М., Яда Ю. Эндотелин-1 как новый меланоген: скоординированная экспрессия его гена и гена тирозиназы в эпидермисе человека, подвергающемся воздействию УФ-В.Джей Инвест Дерматол. 1995; 105:32–37. doi: 10.1111/1523-1747.ep12312500. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]41. Шауэр Э., Траутингер Ф., Кёк А., Шварц А., Бхардвадж Р., Саймон М., Ансель Дж. К., Шварц Т., Люгер Т. А. Пептиды, производные проопиомеланокортина, синтезируются и высвобождаются кератиноцитами человека. Джей Клин Инвест. 1994; 93: 2258–2262. doi: 10.1172/JCI117224. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]42. Yoshida M, Takahashi Y, Inoue S. Гистамин вызывает меланогенез и морфологические изменения путем активации протеинкиназы A через рецепторы h3 в нормальных меланоцитах человека.Джей Инвест Дерматол. 2000; 114:334–342. doi: 10.1046/j.1523-1747.2000.00874.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]43. Сугумаран М. Реактивность хинонметидов по сравнению с о-хинонами в метаболизме катехоламинов и биосинтезе эумеланина. Int J Mol Sci. 2016;17:1576–1579. doi: 10.3390/ijms170. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44. Ню С, Айса Х.А. Повышение активности меланогенеза и тирозиназы: потенциальные агенты при витилиго. Молекулы. 2017; 22:1303–1305. doi: 10.3390/молекулы22081303.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]45. Rzepka Z, Buszman E, Beberok A, Wrześniok D. От тирозина к меланину: сигнальные пути и факторы, регулирующие меланогенез. Postepy Hig Med Dosw. 2016;70:695–708. doi: 10.5604/17322693.1208033. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]46. Д’Искья М., Вакамацу К., Наполитано А., Бриганти С., Гарсия-Боррон Дж. К., Ковач Д., Мередит П., Пеццелла А., Пикардо М., Сарна Т. и др. Меланины и меланогенез: методы, стандарты, протоколы. Пигментно-клеточная меланома Res.2013;26:616–633. doi: 10.1111/pcmr.12121. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]47. Сломински А., Змиевски М.А., Павелек Дж. L-тирозин и L-дигидроксифенилаланин как гормоноподобные регуляторы функций меланоцитов. Пигментно-клеточная меланома Res. 2012; 25:14–27. doi: 10.1111/j.1755-148X.2011.00898.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]48. Холлингер Дж. К., Ангра К., Гальдер Р. М. Эффективны ли натуральные ингредиенты в лечении гиперпигментации? Систематический обзор. J Clin Эстет Дерматол.2018;11:28–37. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]49. Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V. Агенты для отбеливания кожи: перспективы медицинской химии ингибиторов тирозиназы. J Enzyme Inhib Med Chem. 2017; 32: 403–425. doi: 10.1080/14756366.2016.1256882. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]50. Caruntu C, Boda D, Constantin C, Caruntu A, Neagu M. Катехоламины увеличивают пролиферацию in vitro клеток мышиной меланомы B16F10. Acta Endocrinol (Копенг) 2014; 10:545–558. [Google Академия]51.Diaconeasa A, Boda D, Solovan C, Enescu DM, Vîlcea AM, Zurac S. Гистопатологические особенности шпицоидных поражений в разных возрастных группах. Ром Джей Морфол Эмбриол. 2013; 54:51–62. [PubMed] [Google Scholar]53. Зурак С., Неагу М., Константин С., Чиопля М., Недельку Р., Бастиан А., Попп С., Ничита Л., Андрей Р., Тебейка Т. и др. Вариации экспрессии TIMP1, TIMP2 и TIMP3 при меланоме кожи с регрессом и их возможная функция в качестве прогностических предикторов. Онкол Летт. 2016;11:3354–3360. дои: 10.3892/ол.2016.4391. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
Произошла ошибка при настройке файла cookie пользователя
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка браузера на прием файлов cookie
Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie
потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка браузера на прием файлов cookie
Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie
потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.
Реактом | Биосинтез меланина
23710556 |
Меланины и меланогенез: методы, стандарты, протоколы
Пикардо, М,
д’Искья, М,
Ковач, Д,
Наполитано, А,
Вакамацу, К,
Сарна, Т,
Ито, С,
Мередит, П.
Саймон, Джей Ди,
Пеццелла, А,
Гарсия-Боррон, JC,
Бриганти, С.
|
Пигментно-клеточная меланома Res |
2013 |
Границы | Пигмент меланин в растениях: современные знания и перспективы на будущее
Введение
Коричневая и черная окраска семян является широко распространенным признаком растений.Цвет может быть вызван меланином, высокомолекулярным пигментом, образующимся в результате окисления и полимеризации фенолов (Britton, 1985; Solano, 2014). Он присутствует во всех царствах живых организмов, но до сих пор остается самым загадочным пигментом растений. Отсутствие научного внимания к этому растительному пигменту связано с отсутствием очевидных функций, которые можно было бы ему приписать (Thomas, 1955). Долгое время этот растительный пигмент не считался меланином, так как по определению термина «меланин», сформулированному на основе исследований меланина у животных, он должен быть азотсодержащим пигментом; меланин в растениях не содержит азота (Thomas, 1955; Prota, 1992).Сравнительные исследования черных пигментов, выделенных из микроорганизмов, растений и животных, выявили их общие физико-химические свойства, за исключением присутствия азота (Nicolaus et al., 1964). Была пересмотрена терминология, из определения термина «меланин» исключено требование азота (Britton, 1985; Solano, 2014). В настоящее время различают три типа меланина: эумеланины, феомеланины и алломеланины. Эумеланины являются преобладающими формами, обнаруженными у животных и микроорганизмов, а также встречаются у некоторых грибов; феомеланины специфичны для высших животных, млекопитающих или птиц.Оба они являются производными тирозина, но феомеланины состоят из серосодержащих мономерных звеньев, в основном бензотиазина и бензотиазола, вместо индольных звеньев эумеланинов. Растительный и грибковый меланин, лишенный азота, обычно называют алломеланином (другие меланины). Это самая разнородная группа; его предшественники разнообразны. Меланин грибов может образовываться из гамма-глутаминил-3,4-дигидроксибензола, катехола и 1,8-дигидроксинафталина, а возможными предшественниками в растениях считаются катехол, кофейная, хлорогеновая, протокатеховая и галловая кислоты (Лях, 1981). ; Белл и Уилер, 1986; Солано, 2014).Благодаря уникальным свойствам меланина, таким как его стабильное состояние свободных радикалов, поглощение ультрафиолетового и видимого (УФ-видимого) света, способность к комплексообразованию и ионному обмену, эти пигменты вызывают растущий интерес в качестве материалов для широкого спектра биомедицинских и технологические приложения (d’Ischia et al., 2015; Di Mauro et al., 2017; Vahidzadeh et al., 2018). Поскольку растительный меланин в большинстве случаев присутствует в недорогих сельскохозяйственных отходах (например, в виноградных выжимках и шелухе семян подсолнечника), он привлекает к себе особое внимание.Показана перспективность меланина из лузги подсолнечника в качестве сорбента с высокой эффективностью энтеросорбции и антивозрастного агента в эластомерных композициях (Грачева, Желтобрюхов, 2019; Каблов и др., 2019).
По сравнению с животными и микроорганизмами биохимические и молекулярно-генетические аспекты образования меланина у растений изучены в меньшей степени. Одной из причин, помимо сложной полимерной природы пигмента, является то, что растительный меланин накапливается в твердых оболочках семян, где могут присутствовать другие соединения сходной окраски, например проантоцианидины.Представляется ясным, что исходным пунктом любого биохимического и молекулярно-генетического изучения меланогенеза у растений является подтверждение меланической природы пигмента. Для оценки современного состояния исследований меланогенеза растений и определения направлений дальнейших исследований в данном обзоре собраны данные о функциях, локализации и молекулярно-генетическом контроле образования меланина в семенах с акцентом на исследования, в которых изучалась меланическая природа меланина. пигмент был доказан физико-химическими методами.
Физико-химические методы идентификации и изучения меланинов растений
Стандартный протокол обнаружения меланина включает их щелочную экстракцию и последующее осаждение в кислых условиях (Sava et al., 2001). Извлеченное таким образом пигментное вещество представляет собой темный блестящий порошок, нерастворимый в воде и большинстве органических растворителей, частично растворимый в концентрированных серной и азотной кислотах и полностью растворимый в гидроксиде натрия. При воздействии сильных окислителей, таких как перекись водорода, перманганат калия или бромная вода, пигмент теряет свой цвет, а воздействие хлорного железа приводит к осаждению хлопьевидного материала, который постепенно вновь растворяется при повышении концентрации хлорного железа.Результаты реакций свидетельствуют о наличии в составе меланинов хиноидных и фенольных групп (Thomas, 1955; Fox, Kuchnow, 1965; Лях, 1981; Downie et al., 2003; Shoeva et al., 2020).
В дополнение к химическим испытаниям для подтверждения меланической природы пигментов применялись спектроскопические методы. УФ-видимая спектроскопия наиболее широко используется для идентификации и количественного определения меланинов. Меланины различного происхождения характеризуются высоким коэффициентом поглощения в видимой и ультрафиолетовой областях спектра с максимумом при 196–300 нм (Лях, 1981; Pralea et al., 2019). Для идентификации основных функциональных групп в макромолекулах меланина использовалась инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FT-IR). Типичные спектры FT-IR меланина включают характерные полосы для фенольных фрагментов, хинона, алифатических углеводородных групп и ароматического углеродного остова (Mbonyiryivuze et al., 2015; Pralea et al., 2019). Ядерно-магнитный резонанс (ЯМР) можно использовать для подтверждения присутствия в меланинах ароматических атомов водорода и углерода, метильных или метиленовых групп, присоединенных к атомам азота и/или кислорода, NH-групп, связанных с индолом, алкильных фрагментов (Pralea et al., 2019). Меланины являются парамагнитными биополимерами из-за присутствия стабильных свободных радикалов, которые можно обнаружить с помощью спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) (Butterfield, 1982). Характерный сигнал ЭПР меланинов приписывается радикалам семихинона (Enochs et al., 1993).
С помощью химических тестов в сочетании с некоторыми из описанных спектроскопических методов была доказана меланическая природа черных пигментов в семенах следующих видов: арбузы (Nicolaus et al., 1964), подсолнечника (Николаус и др., 1964; Грачева, Желтобрюхов, 2016), гречихи (Журавель, 2010), винограда (Жеребин, Литвина, 1991), томатов (Дауни и др., 2003), душистой маслины (Ванг et al., 2006), жасмин ночной (Kannan, Ganjewala, 2009), кунжут (Panzella et al., 2012), ипомея (Park, 2012), горчица черная и рапс (Yu, 2013), каштан (Yao et al. , 2012), чеснок (Wang, Rhim, 2019), овес (Varga et al., 2016) и ячмень (Shoeva et al., 2020; рис. 1). Обнадеживающие результаты в определении структуры меланинов растений были недавно получены с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией на матрице (MALDI-TOF MS), которая была применена для определения структуры меланина овса, который оказался гомополимер, построенный из p -кумаровой кислоты и состоящий в основном из низкомолекулярных олигомеров, состоящих из 3-9 мономерных звеньев (Varga et al., 2016).
Рисунок 1 . Некоторые виды растений накапливают меланины в семенах; наличие меланинов подтверждено физико-химическими методами. Первый ряд (слева направо): каштан ( Castanea mollissima ) и овес ( Avena sativa ), второй ряд: подсолнух ( Helianthus annuus ), арбуз ( Citrullus lanatus ) и ячмень ( Hordeum vulgare). ), третий ряд: гречиха ( Fagopyrum esculentum ), виноград ( Vítis vinífera ) и ипомея ( Ipomoea purpurea ), четвертый ряд: кунжут ( Sesamum indicum ), рапс 9024 и горчица черная ( Brassica nigra ).
Хотя меланины были подтверждены в семенах нескольких видов растений, тот факт, что эти виды принадлежат к разным таксономическим группам, предполагает более широкое распространение пигментов, чем было продемонстрировано в настоящее время.
Функции пигментов меланина в растениях
Считается, что черная пигментация возникла в результате приспособления живых организмов к неблагоприятным условиям внешней среды. Функциональная важность этого типа пигмента была подробно рассмотрена для животных, насекомых и микроорганизмов (Solano, 2014; Cordero and Casadevall, 2017).Роль пигмента в растениях до сих пор неясна, но собранная информация показывает, что черный цвет может дать и им некоторые преимущества.
Как и у животных, у растений окраска на основе меланина важна для маскировки. Например, большинство дикорастущих злаков имеют черную пигментацию корпуса. Падающие на землю при созревании семена, покрытые черной шелухой, считаются невидимыми для птиц на фоне темной почвы (Zhu et al., 2011).
Из-за способности черных поверхностей поглощать больше солнечной энергии, чем светлые поверхности, и преобразовывать ее в тепло, теоретически семена с черными зернами могут созревать раньше, чем желтые.Сравнительное изучение местных сортов ячменя с черными и белыми семенами показало, что первые созревают раньше, чем вторые (Ceccarelli et al., 1987).
Меланины придают дополнительную механическую прочность оболочкам семян, защищая их от повреждений. Более того, меланин обеспечивает устойчивость к насекомым и вредителям благодаря своей токсичности (Jana and Mukherjee, 2014). У подсолнечника семена с черной оболочкой меньше повреждаются личинками крота, чем белые семена (Pandey and Dhakal, 2001).
Поскольку меланины являются сильными антиоксидантами (Panzella et al., 2012; Lopusiewicz, 2018), они могут придавать больше энергии семенам, которые их накапливают, и могут защищать семена в условиях стресса. Есть несколько примеров, подтверждающих эту гипотезу. У арбуза коричневые семена были более энергичными, чем светлые; они имели более высокую массу семян, процент всхожести и появления всходов, а также массу свежих и сухих проростков, чем семена светлой окраски (Mavi, 2010). У видов Brassica желтые семена с прозрачными семенными оболочками имеют более тонкую оболочку и меньше волокон, чем сорта с темными, более толстыми и более одревесневшими семенами (Marles and Gruber, 2004).Местные стародавние сорта сирийского ячменя с черными семенами выращивают в самых засушливых регионах страны, в отличие от староместных сортов с белым зерном, адаптированных к более мягким условиям выращивания (Ceccarelli et al., 1987). Сравнение этих образцов показало, что образцы с черными зернами более холодо- и засухоустойчивы, чем образцы с белыми зернами (Ceccarelli et al., 1987; Weltzien, 1988). Предпринимались попытки продемонстрировать защитные функции меланина в зерне ячменя в условиях засоления, засухи и токсичности кадмия с использованием точной генетической модели околоизогенных линий (НИЛ), отличающихся окраской зерна.Полученные данные показали, что меланин не дает преимуществ проросткам ячменя в стрессовых условиях (Глаголева и др., 2019). Более убедительные результаты о защитных функциях меланинов были получены при тестировании устойчивости к патогенной инфекции. Сорта ячменя и овса с темной окраской колоса меньше поражались Fusarium , чем сорта без темного пигмента шелухи (Чжоу и др., 1991; Лоскутов и др., 2016). Рекомбинантные инбредные линии ячменя (РИЛ) с черными зернами продемонстрировали более низкую заболеваемость фузариозом и более низкое накопление микотоксина дезоксиниваленола, чем РИЛ с желтыми зернами (Choo et al., 2015).
Известно, что соединения, накапливающиеся в оболочках семян, влияют на период покоя и скорость прорастания семян (Debeaujon et al., 2000; Gu et al., 2011). Это верно в случае флавоноидных пигментов, но в случае меланина были получены некоторые противоречивые результаты. Например, два мутанта томата с темной кожурой, вызванной меланином, показали низкую скорость прорастания и процентное содержание как на воде, так и на гиббереллине по сравнению с семенами дикого типа, в которых пигменты меланина не были обнаружены (Downie et al., 2003). Однако сравнительное изучение всхожести семян ячменя НИЛ с разной окраской зерна не выявило различий между желтыми и черными зернами (Глаголева и др., 2019).
На основании обобщенных данных можно сделать вывод, что меланины не являются необходимыми для растений. Поэтому выявить их функциональную роль, вероятно, затруднительно. Однако широкое распространение этого пигмента предполагает его функциональное значение, которое еще предстоит выявить у растений.
Синтез меланина в растениях и его молекулярно-генетический контроль
Синтез меланина в растениях связан с ферментативными реакциями побурения, происходящими в поврежденных тканях полифенолоксидазами (ПФО), принадлежащими к семейству Cu-содержащих оксидоредуктаз, способных действовать на фенолы в присутствии кислорода (Nicolas et al. ., 1994). Потеря целостности клеточных компартментов из-за старения, повреждения, взаимодействия с вредителями и патогенами или обработки во время послеуборочной обработки и хранения приводит к высвобождению ПФО из пластид, где они находятся, в цитоплазму.ПФО вступают в контакт с вакуолярными фенольными субстратами и образуют высокореакционноспособные или -хиноны. o -хиноны в дальнейшем либо подвергаются неферментативной полимеризации, либо взаимодействуют с другими соединениями, такими как тиолы, аминокислоты и пептиды, с образованием окрашенных продуктов; они также могут медленно взаимодействовать с водой, в результате чего образуются трифенолы, или могут восстанавливаться до исходных фенолов (рис. 2). Поскольку PPO вызывают нежелательное потемнение растительных продуктов, физико-химические свойства этих ферментов изучались на многих экономически важных видах, включая in vitro исследования субстратной специфичности очищенных ферментов (Jukanti, 2017; Taranto et al., 2017). Тем не менее, PPO остаются одним из наиболее интенсивно изучаемых ферментов, поскольку ожидается, что они будут выполнять и другие функции, помимо ферментативной реакции потемнения; из этих возможных функций наиболее интригующей загадкой являются функции, связанные с их локализацией в хлоропластах (Sullivan, 2014; Boeckx et al., 2015, 2017).
Рисунок 2 . Реакции, катализируемые полифенолоксидазой (ПФО) (А и Б), и реакции o -хинона (1–6) по Nicolas et al.(1994). Благодаря активности монофенолазы (или крезолазы) и дифенолазы (или катехолазы) ПФО гидроксилируют монофенолы до o -дифенолов (А) и впоследствии окисляют o -дифенолов до o -хинонов (В) соответственно. Образовавшиеся o -хиноны могут реагировать с другой молекулой фенола с образованием димеров исходного фенола (реакция 1). Эти димеры с o -дифенольной структурой могут быть окислены либо ферментативно, либо другим o -хиноном до коричневого полимера.Путем нуклеофильного присоединения o -хиноны могут взаимодействовать с тиоловыми группами (реакция 2) или аминогруппами аминокислот или пептидов (реакция 3), в результате чего образуются соединения с o -дифенольной структурой, которые могут далее окисляться (с помощью лакказы). или кислород) или реагируют с избытком o -хинонов с образованием окрашенных продуктов. К o -хинонам можно добавить воду, что приведет к трифенолам, которые могут быть окислены ПФО или o -хинонами с образованием p -хинонов (реакция 4).Наконец, реакции с аскорбиновой кислотой или сульфитами приводят к регенерации исходного фенола (реакция 5). Все реакции являются неферментативными, за исключением реакций с лакказой и ПФО. AA-NH *, аминокислоты или пептиды; Asc A, аскорбиновая кислота; R’-SH, малые тиоловые соединения (например, цистеин или глутатион).
Участие ПФО в образовании меланина в интактных тканях семян находится под вопросом. До недавнего времени считалось, что пигменты меланина накапливаются внеклеточно в виде фитомеланинового слоя.Это исключает участие PPO, расположенных в пластидах, в образовании меланина и подразумевает некоторые другие фенолокисляющие ферменты с внеклеточной локализацией в качестве кандидатов на синтез меланина, такие как лакказы, ассоциированные с клеточной стенкой (Wang et al., 2015). Однако недавние наблюдения накопления меланина в меланопластах, происходящих из хлоропластов, выявленных в черных зернах ячменя (Shoeva et al., 2020), заставляют нас пересмотреть связь синтеза меланина с фитомеланиновым слоем. Фитомеланиновый слой был описан как черный, твердый, устойчивый материал, который заполняет межклеточное пространство между гиподермой и склеренхимой в околоплоднике некоторых видов семейства подсолнечника (Pandey and Dhakal, 2001).Химическая структура материала, из которого состоит фитомеланиновый слой, не установлена. Некоторые авторы предполагают, что он немелановый, и считают его производным поливинилароматического спирта (Pandey, Dhakal, 2001; Jana, Mukherjee, 2014). Однако одновременное присутствие фитомеланинового слоя и меланина в семенах некоторых видов, например в шелухе растений подсолнечника (Thomas, 1955; Rogers, Kreitner, 1983; Грачева, Желтобрюхов, 2016), затрудняет их различение. два термина.Поскольку образование меланина происходит внутриклеточно внутри пластид (Shoeva et al., 2020), а внеклеточный фитомеланиновый слой формируется в результате катаболизма гиподермальных клеток (Pandey and Dhakal, 2001), представляется вероятным, что синтез меланина и формирование фитомеланинового слоя различные клеточные процессы, которые следует различать.
Меланопласты обнаружены только в семенах ячменя, и для подтверждения локализации синтеза меланина в пластидах этого типа необходимы дополнительные исследования семян, накапливающих меланин.Однако эта находка, в дополнение к данным о наличии фенольных субстратов ПФО в хлоропластах (Запрометов, Николаева, 2003; Boeckx et al., 2017), позволяет предположить, что ПФО являются основным ферментом, участвующим в меланогенезе растений в интактных семенах. ткани. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные молекулярной генетики, показавшие связь черного цвета семян с генами ПФО. Например, были идентифицированы два комплементарных гена, определяющих черную пигментацию рисовой шелухи: Ph2 , который кодирует PPO, и Bh5 , который кодирует переносчик тирозина (Fukuda et al., 2012). Однако меланическая природа черного пигмента в семенах риса не была подтверждена химически; это можно было предположить только на основании наблюдаемой ассоциации. Ген, кодирующий PPO, недавно был идентифицирован как ген-кандидат, ответственный за пигментацию меланина в семенах арбуза (Li et al., 2020).
Для некоторых других видов растений в настоящее время имеются данные о способах генетического наследования. Показано, что наличие фитомеланинового слоя у семянок подсолнечника является доминантным признаком, который моногенно контролируется геном Pml (Johnson, Beard, 1977).Исследования наследования рисунка пигментации в трех слоях околоплодника подсолнечника также убедительно подтверждают, что присутствие слоя фитомеланин (внешний слой околоплодника) контролируется одним доминантным геном (Mosjidis, 1982).
У ячменя черная окраска шипов, вызванная меланином, находится под моногенным контролем локуса Blp (Costa et al., 2001). Сообщалось о трех доминантных аллелях, Blp1.b , Blp1.mb и Blp1.g , придающих чрезвычайно черный, средний черный и светло-черный или серый цвета соответственно.Отношение сегрегации 3:1 было сообщено для скрещиваний ячменя с различной интенсивностью пигментации семян (Woodward, 1941). На сегодняшний день локус Blp был сужен до 21 гена, и в качестве кандидата был предложен ген, кодирующий пурпурную кислую фосфатазу (Long et al., 2019).
Получены данные об обмене меланина во взаимосвязи с другими метаболическими процессами, протекающими в семенах растений. Показано, что в темных семенах ячменя содержание фенольных соединений и лигнина выше, чем в неокрашенных.Поэтому было высказано предположение, что гены биосинтеза меланина могут быть связаны с путями биосинтеза фенилпропаноидов, такими как пути биосинтеза флавоноидов и лигнинов (Choo et al., 2005; Shoeva et al., 2016). Сравнительный транскриптомный анализ, проведенный с использованием НИЛ ячменя с черными и неокрашенными семенами, показал влияние доминантного аллеля Blp на экспрессию более тысячи генов, среди которых преобладали гены биосинтеза фенилпропаноидов и жирных кислот (Глаголева и др., 2017). У Ipomoea tricolor было показано, что накопление меланинов в семенной кожуре находится под контролем того же гена ItIVS , который кодирует транскрипционный фактор с доменом bHLH, регулирующим биосинтез антоцианов (Park, 2012). У томата эпистатический анализ мутанта bks , который накапливает темные меланиновые пигменты в семенниках, по сравнению с мутантами без антоцианов , у которых нарушен синтез антоцианов, показал, что bks действительно эпистатичен по отношению к мутантам без антоцианов .Данные предполагают, что фенотип черного тмина вызывается повреждением гена, необходимого для стадии, предшествующей ветви биосинтеза флавоноидов (Downie et al., 2003). В подтверждение этого открытия было показано, что гены путей биосинтеза флавоноидов не участвуют в образовании меланина в ячмене (Shoeva et al., 2016). Приведенные примеры показывают, что сравнительные молекулярно-генетические исследования представляют собой эффективное средство понимания синтеза меланина в контексте общих метаболических процессов, происходящих в тканях растений.
Выводы и перспективы
За последнее десятилетие исследования синтеза меланина в растениях значительно продвинулись вперед. Одним из достижений в этой области стало признание того факта, что меланины широко распространены в царстве растений. Хотя их присутствие в семенных оболочках еще не связано с какой-либо очевидной функцией, их широкое распространение предполагает наличие некоторых функций, среди которых наиболее вероятной является защита от патогенов.Обнаружение связи синтеза меланина с внутриклеточными пластидами можно признать еще одним достижением в исследованиях меланина растений. Локализация синтеза меланина в пластидах оболочек зерен показана только у одного вида; для подтверждения этого вывода требуются дополнительные исследования других видов растений. Более того, функциональное значение локализации PPOs в хлоропластах долгое время оставалось нерешенной загадкой. Учитывая данные, представляется вероятным, что присутствие PPO в хлоропластах не является случайностью и может быть непосредственно связано с меланогенезом.Как минимум, такую связь следует исследовать.
Вклад авторов
А.Г. написали первоначальный вариант рукописи, О.С. и Е.К. разработали ее концептуализацию. Все авторы просмотрели и отредактировали рукопись.
Финансирование
Стоимость подготовки и публикации обзора выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 19-76-00018. AG была поддержана проектом ICG 0259-2019-0001.
Конфликт интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
Авторы выражают благодарность фотографу Александру Клепневу за микрофотографии семян растений, накапливающих меланин в своих оболочках, Гербарию ВИР (ВИР) и руководителям семенных отделов за предоставленные для фотосъемки семена ипомеи, кунжута, горчицы, ячменя, овса.
Каталожные номера
Белл, А.А., и Уилер, М.Х. (1986). Биосинтез и функции меланинов грибов. Год. Преподобный Фитопат. 24, 411–451.doi: 10.1146/annurev.py.24.0
.002211
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Бёккс, Т., Уинтерс, А.Л., Уэбб, К.Дж., и Кингстон-Смит, А.Х. (2015). Полифенолоксидаза в листьях: имеет ли значение локализация хлоропласта? Дж. Экспл. Бот. 66, 3571–3579. дои: 10.1093/jxb/erv141
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Бёккс, Т., Уинтерс, А., Уэбб, К.Дж., и Кингстон-Смит, А.Х. (2017). Обнаружение потенциальных хлоропластовых субстратов для полифенолоксидазы предполагает их роль в неповрежденных листьях. Фронт. Растениевод. 8:237. doi: 10.3389/fpls.2017.00237
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Бриттон, Г. (1985). Биохимия природных пигментов . Кембридж: Издательство Кембриджского университета.
Академия Google
Баттерфилд, Д. А. (1982). «Спиновая маркировка при болезнях» в биологическом магнитном резонансе . изд. LJ Berliner (Бостон, Массачусетс: Springer US), 1–78.
Академия Google
Чеккарелли, С., Грандо, С., и Ван Леур, Дж. А. Г. (1987). Генетическое разнообразие местных сортов ячменя из Сирии и Иордании. Euphytica 36, 389–405. дои: 10.1007/BF00041482
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Чу, Т. М., Вигьер, Б., Хо, К. М., Чеккарелли, С., Грандо, С., и Франковяк, Дж. Д. (2005). Сравнение черного, пурпурного и желтого ячменя. Жен. Ресурс. Обрезать. Эвол. 52, 121–126. doi: 10.1007/s10722-003-3086-4
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Чу, Т.M., Vigier, B., Savard, M.E., Blackwell, B., Martin, R., Wang, J., et al. (2015). Черный ячмень как средство снижения загрязнения дезоксиниваленолом. Растениеводство. 55, 1096–1103. doi: 10.2135/cropsci2014.05.0405
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Коста, Дж. М., Кори, А., Хейс, П. М., Джобет, К., Кляйнхофс, А., Копиш-Обуш, А., и соавт. (2001). Молекулярное картирование ячменя орегонского волка: фенотипически полиморфная двойная гаплоидная популяция. Теор.заявл. Жене. 103, 415–424. дои: 10.1007/s001220100622
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Дебожон, И., Леон-Клоостерзил, К.М., и Коорнниф, М. (2000). Влияние кожуры на покой, прорастание и продолжительность жизни семян арабидопсиса . Завод физиол. 122, 403–414. doi: 10.1104/стр.122.2.403
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Ди Мауро, Э., Сюй, Р., Соливери, Г., и Сантато, К. (2017).Натуральные меланиновые пигменты и их интерфейсы с ионами и оксидами металлов: новые концепции и технологии. Миссис Комм. 7, 141–151. doi: 10.1557/mrc.2017.33
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
д’Искья, М., Вакамацу, К., Цикоира, Ф., Ди Мауро, Э., Гарсия-Боррон, Дж. К., Коммо, С., и др. (2015). Меланины и меланогенез: от пигментных клеток до здоровья человека и технологических приложений. Пигментно-клеточная меланома Res. 28, 520–544. doi: 10.1111/pcmr.12393
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Дауни, А.Б., Чжан, Д., Дирк, Л.М.А., Такер, Р.Р., Пфайффер, Дж.А., Дрейк, Дж.Л., и соавт. (2003). Связь между материнской семенной оболочкой и зародышем и/или эндоспермом влияет на характеристики семенной оболочки томата. Завод физиол. 133, 145–160. doi: 10.1104/стр.103.022632
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Енохс, В. С., Нилджес, М. Дж., и Суонц, Х. В.(1993). Стандартизированный тест для идентификации и характеристики меланина с использованием электронной парамагнитной (ЭПР) спектроскопии. Пигментная ячейка Res. 6, 91–99. doi: 10.1111/j.1600-0749.1993.tb00587.x
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Фокс Д.Л. и Кухнов К.П. (1965). Обратимый светоэкранирующий пигмент глаз пластиножаберных: химическая идентичность с меланином. Наука 150, 612–614. doi: 10.1126/наука.150.3696.612
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Фукуда, А., Симидзу Х., Ширацути Х., Ямагути Х., Охдаира Ю. и Мочида Х. (2012). Дополнительные гены, которые вызывают черную созревающую шелуху у растений F1 от скрещивания сортов риса индика и японика. Завод Изд. науч. 15, 270–273. doi: 10.1626/pps.15.270
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Глаголева А.Ю., Шоева О.Ю., Хлесткина Е.К. (2019). «Сравнительная характеристика почти изогенных линий, отличающихся локусом Blp , по устойчивости к абиотическим стрессам» в Актуальные проблемы генетики растений, геномики, биоинформатики и биотехнологии , 89–91.Резюме получено из материалов Пятой международной научной конференции PlantGen2019. doi: 10.18699/ICG-PlantGen2019-28
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Глаголева А.Ю., Шмаков Н.А., Шоева О.Ю., Васильев Г.В., Шацкая Н.В., Бёрнер А. и соавт. (2017). Метаболические пути и гены, идентифицированные с помощью РНК-секвенирующего анализа почти изогенных линий ячменя, различающихся аллельным состоянием гена черной цветковой чешуи и околоплодника ( Blp ). BMC Растение Биол. 17:182. doi: 10.1186/s12870-017-1124-1
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Грачева Н.В., Желтобрюхов В.Ф. (2016). Способ получения меланинов из лузги подсолнечника и изучение ее антиоксидантной активности. Новости Казанский технол. ун-т 19, 154–157.
Академия Google
Грачева Н.В., Желтобрюхов В.Ф. (2019). Сорбционные свойства меланинов лузги подсолнечника. Фарм. хим. J. 53, 337–341. дои: 10.1007/с11094-019-02002-2
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Gu, X.Y., Foley, M.E., Horvath, D.P., Anderson, J.V., Feng, J., Zhang, L., et al. (2011). Связь между состоянием покоя семян и цветом околоплодника контролируется плейотропным геном, который регулирует синтез абсцизовой кислоты и флавоноидов в сорном красном рисе. Генетика 189, 1515–1524. doi: 10.1534/genetics.111.131169
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Яна, Б.К. и Мукерджи, С.К. (2014). Заметки о распределении фитомеланинового слоя у высших растений — краткое сообщение. Дж. Фарм. биол. 4, 131–132.
Академия Google
Джонсон, А.Л., и Бирд, Б.Х. (1977). Повреждение подсолнечной молью и наследование фитомеланинового слоя семянок подсолнечника. Растениеводство. 17, 369–372. doi: 10.2135/cropsci1977.0011183X001700030007x
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Юканти, А. (2017). Полифенолоксидазы (ПФО) в растениях . Сингапур: Спрингер.
Академия Google
Каблов В. Ф., Новопольцева О. М., Грачева Н. В., Желтобрюхо В. Ф., Дао П. К. (2019). Перспективы применения меланинов в качестве антивозрастных агентов в эластомерных композициях. Вьетнам J. Chem. 57, 255–260. doi: 10.1002/vjch.201960024
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Каннан, П., и Ганджевала, Д. (2009). Предварительная характеристика меланина, выделенного из плодов и семян nyctanthes arbortristis. J. Sci. Рез. 1, 655–661. DOI: 10.3329/jsr.v1i3.2005
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Li, B., Lu, X., Gebremeskel, H., Zhao, S., He, N., Yuan, P., et al. (2020). Генетическое картирование и открытие гена-кандидата для черного цвета оболочки семян арбуза ( Citrullus lanatus ). Фронт. Растениевод. 10:1689. doi: 10.3389/fpls.2019.01689
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Лонг З., Цзя Ю., Tan, C., Zhang, X.-Q., Angessa, T., Broughton, S., et al. (2019). Генетическое картирование и эволюционный анализ признака черного зерна у ячменя. Фронт. Растениевод. 9:1921. doi: 10.3389/fpls.2018.01921
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Лопусевич, Л. (2018). Антиоксидантные, антибактериальные свойства и оценка светонепроницаемости сырых и очищенных меланинов, выделенных из семян Citrullus lanatus (арбуз). Герба Пол. 64, 25–36. doi: 10.2478/hepo-2018-0008
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Лоскутов И.Г., Блинова Е.В., Гаврилова О.П., Гагкаева Т.Ю. (2016). Ценностная характеристика генотипов овса и устойчивость к фузариозу . Вавилов Ю. Жене. Порода. 20, 286–294. дои: 10.18699/VJ16.151
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Лях С.П. (1981). Микробный меланогенез и его функции. Наука , 22–270.
Академия Google
Марлес, М.С., и Грубер, М.Ю. (2004). Гистохимическая характеристика неэкстрагируемых пигментов кожуры семян и количественное определение экстрагируемого лигнина у Brassicaceae. J. Sci. Фуд Агрик. 84, 251–262. doi: 10.1002/jsfa.1621
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Мави, К. (2010). Взаимосвязь между цветом семенной кожуры и качеством семян арбуза малинового сладкого. Хортик. науч. 37, 62–69. doi: 10.17221/53/2009-HORTSCI
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Мбоньириивузе, А., Мвакикунга, Б., Дхламини, С.М., и Мааза, М. (2015). Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье для меланина сепии. Физ. Матер. хим. 3, 25–29. дои: 10.12691/PMC-3-2-2
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Мосджидис, Дж. А. (1982). Наследование окраски околоплодника и венчика дисковых соцветий подсолнечника. Дж. Херед. 73, 461–464. doi: 10.1093/oxfordjournals.jhered.a109698
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Николя, Дж.J., Richard-Forget, F.C., Goupy, P.M., Amiot, M., and Aubert, S.Y. (1994). Ферментативные реакции потемнения в яблоках и яблочных продуктах. Крит. Преподобный Food Sci. Нутр. 34, 109–157. дои: 10.1080/10408399409527653
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Пандей, А.К., и Дхакал, М.Р. (2001). Фитомеланин в сложноцветных. Курс. науч. 80, 933–940.
Академия Google
Панцелла, Л., Эйденбергер, Т., Наполитано, А.и Д’Искья, М. (2012). Пигмент черного кунжута: очистка на основе анализа DPPH, антиоксидантные/антинитрозирующие свойства и идентификация структурного маркера деградации. Дж. Агрик. Пищевая хим. 60, 8895–8901. дои: 10.1021/jf2053096
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Парк, К.И. (2012). Белок bHLH частично контролирует проантоцианидиновую и фитомеланиновую пигментацию в кожуре семян ипомеи Ipomoea tricolor . Хортик.Окружающая среда. Биотехнолог. 53, 304–309. doi: 10.1007/s13580-012-0006-6
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Pralea, I.E., Moldovan, R.C., Petrache, A.M., Ilieș, M., Hegheș, S.C., Ielciu, I., et al. (2019). От экстракции до передовых аналитических методов: проблемы анализа меланина. Междунар. Дж. Мол. науч. 20:3943. дои: 10.3390/ijms20163943
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Прота, Г. (1992). Меланины и меланогенез .Лондон: Академическая пресса.
Академия Google
Роджерс, К.Е., и Крайтнер, Г.Л. (1983). Фитомеланин семянок подсолнечника: механизм устойчивости околоплодника к истиранию личинками подсолнечной огневки ( Lepidoptera : Pyralidae ). Окружающая среда. Энтомол. 12, 277–285. doi: 10.1093/ee/12.2.277
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Сава, В.М., Ян, С.-М., Хонг, М.-Ю., Ян, П.-К., и Хуанг, Г.С. (2001). Выделение и характеристика мелановых пигментов, полученных из чая и полифенолов чая. Пищевая хим. 73, 177–184. doi: 10.1016/S0308-8146(00)00258-2
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Шоева О.Ю., Мурсалимов С.Р., Грачева Н.В., Глаголева А.Ю., Бернер А., Хлесткина Е.К. (2020). Образование меланина в зерне ячменя происходит в пластидах клеток околоплодника и шелухи. наук. Респ. 10:179. doi: 10.1038/s41598-019-56982-y
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Шоева О.Ю., Мок Х.-П., Кукоева Т.В., Бернер А. и Хлесткина Е. К. (2016). Регуляция генов пути биосинтеза флавоноидов в пурпурных и черных зернах Hordeum vulgare . PLoS One 11:e0163782. doi: 10.1371/journal.pone.0163782
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Солано, Ф. (2014). Меланины: пигменты кожи и многое другое — типы, структурные модели, биологические функции и пути образования. New J. Sci. 2014, 1–28. дои: 10.1155/2014/498276
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Таранто, Ф., Паскуалоне А., Манджини Г., Триподи П., Миацци М., Паван С. и соавт. (2017). Полифенолоксидазы в сельскохозяйственных культурах: биохимические, физиологические и генетические аспекты. Междунар. Дж. Мол. науч. 18:377. дои: 10.3390/ijms18020377
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Томас, М. (1955). «Меланины» в Современные методы анализа растений/Moderne Methoden der Pflanzenanalyse . ред. К. Паех и М. В. Трейси (Гейдельберг, Берлин: Springer), 661–675.
Академия Google
Вахидзаде Э., Калра, А. П., и Шанкар, К. (2018). Электроника на основе меланина: от протонных проводников до фотовольтаики и не только. Биосенс. Биоэлектрон. 122, 127–139. doi: 10.1016/j.bios.2018.09.026
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Варга, М., Беркеси, О., Дарула, З., Мэй, Н.В., и Палагьи, А. (2016). Структурная характеристика алломеланина черного овса. Фитохимия 130, 313–320. doi: 10.1016/j.phytochem.2016.07.002
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Ван, Дж., Фэн Дж., Цзя В., Чанг С., Ли С. и Ли Ю. (2015). Инженерия лигнина посредством модификации лакказы: многообещающая область для улучшения энергетических установок. Биотехнология. Биотопливо 8:145. doi: 10.1186/s13068-015-0331-y
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Ван, Х., Пан, Ю., Тан, X., и Хуанг, З. (2006). Выделение и характеристика меланина из семян Osmanthus fragrans ’. LWT Food Sci. Технол. 39, 496–502. doi: 10.1016/j.lwt.2005.04.001
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Ван, Л.Ф., и Рим, Дж.В. (2019). Выделение и характеристика меланина из черного чеснока и чернил сепии. LWT 99, 17–23. doi: 10.1016/J.LWT.2018.09.033
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Вельцин, Э. (1988). Оценка популяций стародавних сортов ячменя ( Hordeum vulgare L.), происходящих из различных регионов выращивания на Ближнем Востоке. Порода растений. 101, 95–106.doi: 10.1111/j.1439-0523.1988.tb00273.x
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Вудворд, Р. В. (1941). Наследование меланиноподобного пигмента в чешуях и зерновках ячменя. Дж. Агрик. Рез. 63, 21–28.
Академия Google
Яо, З., Ци, Дж., и Ван, Л. (2012). Выделение, фракционирование и характеристика меланиноподобных пигментов из скорлупы каштана ( Castanea mollissima ). J. Food Sci. 77, 671–676. дои: 10.1111/j.1750-3841.2012.02714.x
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Запрометов М.Н., Николаева Т.Н. (2003). Хлоропласты, выделенные из листьев фасоли, способны к биосинтезу фенольных соединений. Рус. J. Физиол растений. 50, 623–626. дои: 10.1023/A:1025683922953
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Жеребин Ю.Л. и Литвина Т.М. (1991). Производство водорастворимых фитомеланинов. Хим. Нац. комп. 27, 649–650.дои: 10.1007/BF00630388
Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google
Чжоу, X., Чао, М., и Лян, X. (1991). Скрининг и испытание сортов ячменя на устойчивость к парше. Acta Phytophylacica Sin. 18, 261–265.
Академия Google
Zhu, B.-F., Si, L., Wang, Z., Jingjie Zhu, Y.Z., Shangguan, Y., Lu, D., et al. (2011). Генетический контроль перехода от черной к соломенно-белой оболочке семян при одомашнивании риса. Завод физиол. 155, 1301–1311.doi: 10.1104/стр.110.168500
Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google
Журавель О. И. (2010). Изучение меланина из околоплодников гречихи (Fagopyron saggitatum). Фармацевтический журнал 6, 93–96.
Академия Google
Силимарин ингибирует синтез меланина в клетках меланоцитов | Журнал фармации и фармакологии
Аннотация
Цели
Целью был поиск ингибиторов меланогенеза из природных ресурсов.
Методы
Было изучено ингибирующее действие силимарина на меланогенез в спонтанно иммортализованной клеточной линии меланоцитов мыши Mel-Ab.
Ключевые результаты
Силимарин существенно предотвращал выработку меланина дозозависимым образом со значением IC50 (концентрация, обеспечивающая 50% максимальное ингибирование) 28,2 мкг/мл, без влияния на жизнеспособность клеток. Кроме того, силимарин ингибировал окислительную активность l-DOPA тирозиназы, ограничивающего скорость меланогенного фермента, в клеточных системах, но не влиял непосредственно на активность внеклеточной тирозиназы.Кроме того, вестерн-блоттинг показал, что силимарин снижает экспрессию белка тирозиназы.
Выводы
Это исследование предполагает, что депигментирующий эффект силимарина может быть связан с ингибированием экспрессии тирозиназы и что силимарин может быть полезен в качестве естественного осветляющего кожу агента.
Введение
Меланины синтезируются в меланосомах меланоцитов млекопитающих. Хотя меланины защищают кожу от вредного воздействия окружающей среды и солнечного света, повышенная выработка меланина может вызывать кожные заболевания, в том числе приобретенную гиперпигментацию, такую как меланодермия, поствоспалительная меланодермия и солнечное лентиго. [1] Осветлители кожи применяются для профилактики и лечения мелазмы, веснушек и пигментных пятен в западных странах. [2]
Пигментация может регулироваться во время развития меланоцитов, и основным фактором, определяющим фенотип пигмента, является рецептор меланокортина-1 (MC1R). [3] В эпидермисе млекопитающих вырабатывается альфа-меланоцитостимулирующий гормон (α-МСГ), агонист MC1R, который активирует аденилатциклазу с образованием циклического АМФ (цАМФ). цАМФ частично оказывает свое действие через протеинкиназу А (ПКА).PKA, в свою очередь, фосфорилирует и активирует белок, связывающий цАМФ-ответный элемент (CREB), который связывается с цАМФ-ответным элементом (CRE), присутствующим в промоторе M гена фактора транскрипции, ассоциированного с микрофтальмом (Mitf), который имеет ключевое значение для экспрессии меланогенные ферменты, включая тирозиназу, родственный тирозиназе белок-1 (TRP-1) и TRP-2.
Тирозиназа является основным меланосомным ферментом в меланогенезе и катализирует реакцию ограничения скорости меланогенеза. [4–6] Таким образом, выработка меланина в основном зависит от экспрессии и активации тирозиназы. [7]
Силимарин представляет собой полифенольный флавоноидный комплекс, выделенный из расторопши пятнистой ( Silybum marianum L. Gaertn.), и состоит из нескольких флавонолигнанов, включая силибин, изосилибин, силидианин, силикристин и другие фенольные соединения. [8] Силимарин — гепатопротекторный препарат, широко применяемый в терапии различных заболеваний печени. [9] Кроме того, ранее сообщалось об антиоксидантном, антиканцерогенном и противовоспалительном действии силимарина. [10,11] В частности, показано, что силимарин и силибин предотвращают рак кожи; [12–14] однако об ингибирующем эффекте силимарина на меланогенез еще не сообщалось.
В этом исследовании мы исследовали влияние силимарина на синтез меланина и активность тирозиназы в спонтанно иммортализованной клеточной линии меланоцитов мыши, Mel-Ab.
Материалы и методы
Реагенты
Силимарин был приобретен у Sigma-Aldrich Co.(Сент-Луис, Миссури, США). Силимарин растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранили при -20°С в виде маточного раствора (100 мМ). Холерный токсин, 12- O -тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТРА), l-ДОФА и тирозиназу грибов были получены от Sigma-Aldrich Co. Антитела против тирозиназы (С-19) и актина (I-19) были приобретены у Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Санта-Круз, США).
Культуры клеток
Mel-Ab представляет собой спонтанно иммортализованную клеточную линию меланоцитов мышиного происхождения, которая продуцирует большое количество меланина. [15] Клетки Mel-Ab поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 100 нМ TPA, 1 нМ холерного токсина, 50 мкг/мл стрептомицина и 50 ЕД/мл. пенициллином при 37°С во влажном инкубаторе с 5% СО 2 .
Анализ жизнеспособности клеток
Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа кристаллического фиолетового. Клетки Mel-Ab [15] высевали с плотностью 1 × 10 5 клеток на лунку 6-луночного планшета и инкубировали при 37°С.После инкубации с исследуемым веществом в течение 24 ч культуральную среду удаляли, клетки окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым в 10% этаноле в течение 5 мин при комнатной температуре и 4 раза промывали дистиллированной водой. Кристаллический фиолетовый, удерживаемый прилипшими клетками, затем экстрагировали 95%-ным этанолом. Поглощение определяли при 590 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США).
Измерение содержания меланина
Содержание меланина измеряли, как описано ранее [16] с небольшими изменениями.Клетки Mel-Ab инкубировали при плотности 1×10 5 клеток на лунку 6-луночного планшета при 37°С. Через 24 ч клетки обрабатывали тестируемыми веществами в среде DMEM, содержащей 2% FBS, в течение четырех дней. Осадок клеток растворяли в 1 мл 1 м NaOH при 100°С в течение 30 мин и центрифугировали при 16 000 g в течение 20 мин. Оптическую плотность (ОП) супернатантов измеряли при 400 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов.
Активность тирозиназы
Тирозиназную активность определяли как описано ранее [17] с небольшими изменениями.Вкратце, клетки Mel-Ab обрабатывали тестируемыми веществами в различных концентрациях в течение четырех дней, клетки промывали ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS) и лизировали фосфатным буфером (pH 6,8), содержащим 1% Triton X-100. Затем клетки разрушали замораживанием и оттаиванием, а лизаты осветляли центрифугированием при 10 000 g в течение 5 мин. После количественного определения уровней белка и корректировки концентраций с помощью лизирующего буфера по 90 мкл каждого лизата, содержащего эквивалентные количества белка, помещали в каждую лунку 96-луночного планшета, а затем добавляли по 10 мкл 10 мМ л-ДОФА в каждую лунку. хорошо.Контрольные лунки содержали 90 мкл лизирующего буфера и 10 мкл 10 мМ л-ДОФА. После инкубации при 37°С оптическую плотность измеряли каждые 10 мин в течение не менее 1 ч при 475 нм с использованием ридера для микропланшетов.
Бесклеточная система анализа использовалась для проверки прямого воздействия на активность тирозиназы. Вкратце, 170 мкл фосфатного буфера, содержащего различные концентрации тестируемых веществ, смешивали с 10 мкл грибной тирозиназы (2000 ЕД/мл) или с 10 мкл мышиной тирозиназы, содержащей 20 мкг общего белка, экстрагированного из меланоцитов мыши, и 20 мкл 10 мм л-ДОФА добавляли в каждую лунку.После инкубации при 37°С измеряли оптическую плотность при 475 нм.
Вестерн-блоттинг
клеток Mel-Ab высевали с плотностью 1 × 10 5 клеток на лунку 6-луночного планшета и инкубировали при 37°С. После инкубации с тестируемыми веществами в течение четырех дней клетки собирали и лизировали в буфере для лизиса клеток (62,5 мМ Трис-HCl, 2% додецилсульфат натрия (SDS), 5% β-меркаптоэтанол, 2 мМ фенилметилсульфонилфторид, ингибиторы протеазы (Complete ; Roche, Мангейм, Германия), 1 мМ Na 3 VO 4 , 50 мМ NaF и 10 мМ ЭДТА, pH 6.8). Двадцать микрограммов белка на дорожку разделяли с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и затем переносили на мембрану PVDF. Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком в буфере TBST (25 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,5) в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем инкубировали в течение ночи при 4°C с антигеном. антитело к тирозиназе в разведении 1 : 500. После промывки буфером TBST блот инкубировали с антителом к козьему IgG, конъюгированным с пероксидазой хрена, в разведении 1 : 1000 в течение 2 ч при комнатной температуре.Блотированные антитела визуализировали методом хемилюминесценции (набор ECL; Amersham, UK).
Статистика
Все экспериментальные данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Различия между результатами оценивали с помощью критерия Крускала-Уоллиса, а затем критерия Данна. P < 0,05 считалось значимым.
Результаты
Влияние силимарина на меланогенез в меланоцитах
Чтобы исследовать возможное цитотоксическое действие силимарина на меланоциты Mel-Ab, мы обрабатывали клетки силимарином в различных концентрациях и определяли жизнеспособность клеток с помощью анализа кристаллического фиолетового.Силимарин не оказывал значительного цитотоксического действия на клетки Mel-Ab в диапазоне концентраций 1–50 мкг/мл, что указывает на то, что ингибирующее действие силимарина на выработку меланина не было связано с его неспецифической клеточной токсичностью (данные не представлены).
Затем мы исследовали влияние силимарина на меланогенез в меланоцитах Mel-Ab. Клетки подвергали воздействию силимарина в концентрации 1–50 мкг/мл в течение четырех дней и измеряли содержание в них меланина. Силимарин оказывал дозозависимый ингибирующий эффект у 38.5%, 46,9% и 64,9% ингибирования при 10, 20 и 50 мкг/мл соответственно (IC50 28,2 мкг/мл) (рис. 1). Фенилтиомочевина, хорошо известный ингибитор синтеза тирозиназы и меланина, также проявляла ингибирующий эффект с ингибированием на 79% при 10 мкг/мл. [18]
Рисунок 1
Влияние силимарина на синтез меланина в клетках Mel-Ab. Клетки культивировали с 0–50 мкг/мл силимарина в течение четырех дней и измеряли содержание меланина, как описано в разделе «Материалы и методы».ПТУ, фенилтиомочевина. Показанные результаты являются средними значениями трех повторных экспериментов ± стандартное отклонение. * P < 0,05, ** P < 0,01 по сравнению с контролем.
Рисунок 1
Влияние силимарина на синтез меланина в клетках Mel-Ab. Клетки культивировали с 0–50 мкг/мл силимарина в течение четырех дней и измеряли содержание меланина, как описано в разделе «Материалы и методы». ПТУ, фенилтиомочевина. Показанные результаты являются средними значениями трех повторных экспериментов ± стандартное отклонение. * Р < 0,05, ** Р < 0.01 по сравнению с контролем.
Влияние силимарина на активность тирозиназы
Тирозиназа является ключевым ферментом в синтезе меланина. Таким образом, затем мы определили, влияет ли силимарин на активность тирозиназы. Чтобы изучить клеточную ингибирующую активность силимарина в отношении тирозиназы, мы обработали клетки Mel-Ab силимарином в течение четырех дней, а затем оценили тирозиназную активность клеточных лизатов путем измерения активности окисления l-DOPA. Как показано на рисунке 2, активность тирозиназы снижалась в зависимости от дозы в обработанных силимарином клетках с 21.Ингибирование 9%, 33,8% и 55,5% при 5, 10 и 20 мкг/мл. Это хорошо согласуется с ингибирующим действием силимарина на синтез меланина (рис. 1).
Рисунок 2
Влияние силимарина на активность тирозиназы в клетках Mel-Ab. Клетки культивировали с 0–20 мкг/мл силимарина в течение четырех дней и измеряли клеточную тирозиназную активность, как описано в разделе «Материалы и методы». Показанные результаты являются средними значениями трех повторных экспериментов ± стандартное отклонение. * P < 0.05, ** P < 0,01 по сравнению с контролем.
Рисунок 2
Влияние силимарина на активность тирозиназы в клетках Mel-Ab. Клетки культивировали с 0–20 мкг/мл силимарина в течение четырех дней и измеряли клеточную тирозиназную активность, как описано в разделе «Материалы и методы». Показанные результаты являются средними значениями трех повторных экспериментов ± стандартное отклонение. * P < 0,05, ** P < 0,01 по сравнению с контролем.
Многие средства для отбеливания кожи ингибируют каталитическую активность тирозиназы грибов.Таким образом, чтобы проверить, ингибирует ли силимарин непосредственно фермент тирозиназу, было исследовано его действие в бесклеточной системе. Однако, как показано на рисунке 3, силимарин не ингибировал активность тирозиназы грибов даже при 100 мкг/мл, и аналогичный результат был получен при использовании мышиной тирозиназы. Койевая кислота, хорошо известный ингибитор тирозиназы, полученный из видов грибов, оказывает сильное ингибирующее действие на тирозиназу мышей и грибов с ингибированием на 66,7% при 10 мкг/мл. [19]
Рисунок 3
Влияние силимарина на активность внеклеточной тирозиназы.Чтобы проверить прямое влияние силимарина на тирозиназу грибов и мышей, активность l-DOPA-оксидазы измеряли, как описано в разделе «Материалы и методы». Затемненные столбцы, тирозиназа грибов; открытые колонки, мышиная тирозиназа. Показанные результаты являются средними значениями трех повторных экспериментов ± стандартное отклонение.
Рисунок 3
Влияние силимарина на активность внеклеточной тирозиназы. Чтобы проверить прямое влияние силимарина на тирозиназу грибов и мышей, активность l-DOPA-оксидазы измеряли, как описано в разделе «Материалы и методы».Затемненные столбцы, тирозиназа грибов; открытые колонки, мышиная тирозиназа. Показанные результаты являются средними значениями трех повторных экспериментов ± стандартное отклонение.
Влияние силимарина на экспрессию тирозиназы
Для изучения механизма депигментирующего действия силимарина был проведен вестерн-блоттинг лизатов клеток Mel-Ab. Как показано на рисунке 4, силимарин снижал уровни белка тирозиназы с эффективностью, аналогичной его ингибирующей активности в отношении синтеза меланина и активности тирозиназы, что позволяет предположить, что силимарин ингибирует синтез меланина путем снижения экспрессии белка тирозиназы в клетках меланоцитов Mel-Ab.
Рисунок 4
Влияние силимарина на экспрессию меланогенной протеинтирозиназы. (а) Клетки Mel-Ab культивировали с 0–20 мкг/мл силимарина в течение четырех дней. Затем лизаты цельных клеток подвергали вестерн-блоттингу с использованием антител против тирозиназы. Аналогичные результаты наблюдались в трех независимых экспериментах. (b) Относительная плотность полосы белка тирозиназы выражена в процентах от интенсивности сигнала по отношению к контролю, обработанному носителем.Показанные результаты являются средними значениями трех повторных экспериментов ± стандартное отклонение. * P < 0,05, ** P < 0,01 по сравнению с контролем.
Рисунок 4
Влияние силимарина на экспрессию меланогенной протеинтирозиназы. (а) Клетки Mel-Ab культивировали с 0–20 мкг/мл силимарина в течение четырех дней. Затем лизаты цельных клеток подвергали вестерн-блоттингу с использованием антител против тирозиназы. Аналогичные результаты наблюдались в трех независимых экспериментах. (b) Относительная плотность полосы белка тирозиназы выражена в процентах от интенсивности сигнала по отношению к контролю, обработанному носителем.Показанные результаты являются средними значениями трех повторных экспериментов ± стандартное отклонение. * P < 0,05, ** P < 0,01 по сравнению с контролем.
Обсуждение
Силимарин продемонстрировал дозозависимое ингибирующее действие на меланогенез в меланоцитах Mel-Ab без каких-либо значительных цитотоксических эффектов. Силимарин широко используется в терапии человека для улучшения функции печени из-за его гепатопротекторных и антиоксидантных свойств. [20] В частности, сообщалось, что силимарин и его основное соединение, силибин, предотвращают рак кожи путем модулирования регуляторов клеточного цикла, активации путей митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и ингибирования передачи сигналов Akt. [12] Также хорошо известно, что силимарин проявляет антиканцерогенное и противовоспалительное действие. [21–24] Некоторые исследования также показали, что противовоспалительные соединения могут быть полезны для профилактики или лечения поствоспалительной гиперпигментации. [25] Сообщалось, что глабридин из экстрактов солодки, [26] спиртовые экстракты из Areca catechu L [27] и глобулузин А и эукаглобулин из Eucalyptus globules -воспалительная активность, а также антимеланогенезный эффект за счет подавления провоспалительных цитокинов.Также сообщалось, что силимарин подавлял выработку интерлейкина-1β (IL-1β) и простагландина E2 (PGE-2), продуцируемых циклооксигеназой-2 (ЦОГ-2) [22] , а также фактором некроза опухоли-α (TNF). -а). [24] Кроме того, силибинин, основной компонент силимарина, снижает индуцируемую синтазы оксида азота (iNOS) и ЦОГ-2, а также ядерный фактор κB (NF-κB). [23] Таким образом, может показаться, что антимеланогенезная активность силимарина может быть связана с его противовоспалительным действием, но эту связь еще предстоит охарактеризовать.
Тирозин является ключевым ферментом в синтезе меланина, и мы обнаружили, что силимарин дозозависимо снижает активность тирозина в клетках Mel-Ab, но не ингибирует активность тирозина грибов в бесклеточной системе. Это позволяет предположить, что ингибирующее действие силимарина на меланогенез не обусловлено его прямым ингибированием активности тирозиназы.
Спорные результаты были получены при использовании очищенной тирозиназы грибов или клеточных лизатов. [25] Например, терреин, грибковый метаболит, выделенный из Aspergillus terreus , сильно ингибирует синтез меланина, но не ингибирует каталитическую активность тирозиназы грибов или человека. [29] Недавно Sato et al. [30] сообщили, что ацетилсалициловая кислота ингибирует синтез меланина путем подавления экспрессии тирозиназы, но не влияет на активность тирозиназы грибов. Таким же образом силимарин снижал активность клеточной тирозиназы без прямого ингибирования каталитической активности этого фермента в бесклеточной системе.
Наши результаты показали, что силимарин ингибирует синтез меланина за счет снижения экспрессии белка тирозиназы в клетках меланоцитов Mel-Ab с той же эффективностью, с которой он ингибирует синтез меланина и активность тирозиназы.Пролиферация и дифференцировка эпидермальных меланоцитов млекопитающих регулируются многочисленными генами [31] и окружающей тканевой средой, особенно кератиноцитами. Кроме того, сообщалось, что пигментация может регулироваться факторами, происходящими из кератиноцитов, посредством сигнальных путей, опосредованных рецепторами. Известно, что среди этих факторов PGE-2 и PGF-2α продуцируются и высвобождаются из кератиноцитов, связываются с рецепторами EP1, EP3 и FP и стимулируют меланогенез через цАМФ-независимую фосфолипазу C, тогда как α-MSH действует через цАМФ-опосредованную фосфолипазу C. Путь ПКА.В предыдущих отчетах изучалось влияние простагландинов на процесс меланогенеза. Абдель-Малек и др. [32] показали, что PGE-1 и PGE-2 повышают активность тирозиназы, а Scott et al. [33] предположили, что PGF-2α способствует пигментации после ультрафиолетового облучения и во время воспаления. Кроме того, Sasaki и др. [34] сообщили о стимулирующем действии PGF-2α и PGE-2 на фолликулярный меланогенез в мышиной модели. Также сообщалось, что силимарин подавлял продукцию PGE-2 в макрофагах. [22] Таким образом, мы предположили, что ингибирование экспрессии тирозиназы силимарином может быть связано с подавлением продукции PGE-2 в данной системе анализа. В настоящее время проводятся дальнейшие исследования механизма депигментации силимарина.
Выводы
Мы оценили гипопигментный эффект силимарина в клетках меланоцитов мыши Mel-Ab. Силимарин не влиял на жизнеспособность клеток в используемых концентрациях, что указывает на то, что силимарин не был цитотоксичен для клеток Mel-Ab.Силимарин значительно снижал содержание меланина со значением IC50 28,2 мкг/мл, и было обнаружено, что вызванная силимарином гипопигментация коррелирует с ингибированием активности клеточной тирозиназы, но не с каталитической активностью этого фермента. Кроме того, силимарин также снижал уровень белка тирозиназы. Эти результаты свидетельствуют о том, что силимарин ингибирует синтез меланина за счет снижения активности и экспрессии тирозиназы. Дальнейшие исследования сигнальных путей, регулирующих тирозиназу, находятся в стадии изучения.
Таким образом, силимарин ингибирует синтез меланина путем снижения экспрессии белка тирозиназы без цитотоксичности в клеточной линии меланоцитов мыши, Mel-Ab. Следовательно, силимарин может иметь потенциал в качестве средства для осветления кожи.
Декларации
Конфликт интересов
Автор(ы) заявляют(ют), что у них нет конфликта интересов, о котором следует сообщать.
Финансирование
Это исследование было поддержано грантом (A050432) исследовательского проекта Korea Health 21 Министерства здравоохранения и социального обеспечения Республики Корея.
Каталожные номера
1
Ортонн
JP
, Нордлунд
JJ.
Механизмы , вызывающие аномальный цвет кожи
. В: Norlund
JJ
et al. ред. Пигментная система: физиология и патофизиология
. Нью-Йорк
: Oxford University Press
, 1998
: 489
– 502
.2
Солано
F.
Гипопигментирующие агенты: обновленный обзор биологических, химических и клинических аспектов
. Разрешение пигментных ячеек
2006
; 19
: 550
– 571
.3
Lin
JY
, Fisher
DE.
Биология меланоцитов и пигментация кожи
. Природа
2007
; 445
: 843
– 850
.4
Слушание
VJ
, Хименес
М.
Анализ пигментации млекопитающих на молекулярном уровне
. Разрешение пигментных ячеек
1989
; 2
: 75
– 85
.5
Кобаяши
Т.
и др. Родственный тирозиназе белок 1 (TRP1) действует как DHICA-оксидаза в биосинтезе меланина
. EMBO J
1994
; 13
: 5818
– 5825
.6
Йокояма
К.
и др. Молекулярное клонирование и функциональный анализ кДНК, кодирующей человеческий DOP Белок-2, родственный ахромтаутомеразе/тирозиназе
. Биохим Биофиз Акта
1994
; 1217
: 1217
: 317
— 317
— 321
.7
Слушание
VJ
, Tsukamoto
K.
Ферментативное управление пигментацией у млекопитающих
. FASEB J
1991
; 5
: 2902
– 2909
.8
Скоттова
Н.
, Кречман
В.
Силимарин как потенциальный гипохолестеринемический препарат
. Физиол Рез
1998
; 47
: 1
– 7
.9
Саллер
Р.
и др. Применение силимарина при лечении заболеваний печени
. Наркотики
2001
; 61
: 2035
– 2063
.10
Пьетранджело
А.
и др. Антиоксидантная активность силибина in vivo при длительной перегрузке железом у крыс
. Гастроэнтерология
1995
; 109
: 1941
– 1949
.11
Газак
Р.
и др. Окисленные производные силибина и их антирадикальная и антиоксидантная активность
. Bioorg Med Chem
2004
; 12
: 5677
– 5687
.12
Gu
M.
и др. Силибинин защищает от фотоканцерогенеза посредством модуляции регуляторов клеточного цикла, митоген-активируемых протеинкиназ и передачи сигналов Akt
. Рак Res
2004
; 64
: 649
: 6349
— 6349
— 6349
— 6356
.13
Singh
RP
, Agarwal
R.
Флавоноидный антиоксидантный силимин и рак кожи
. Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал
2002
; 4
: 655
– 663
.14
Singh
RP
, Agarwal
R.
Механизмы и доклиническая эффективность силибинина в предотвращении рака кожи
. Eur J Рак
2005
; 41
: 1969
– 1979
.15
Дули
TP
и др. Разработка Первичный скрининг in vitro средств против депигментации кожи и средств против меланомы
. Skin Pharmacol
1994
; 7
: 188
– 200
.16
Цубои
Т.
и др. Усиление меланогенеза, индуцированное переносом гена тирозиназы, увеличивает поглощение бора и эффект уничтожения бор-нейтронозахватной терапией при меланомной меланоме
. Разрешение пигментных ячеек
1998
; 11
: 275
– 282
.17
Буска
Р.
и др. Ингибирование фосфатидилинозитол-3-киназы/p70(S6)-киназы индуцирует дифференцировку клеток меланомы B16
. J Biol Chem
1996
; 271
: 31824
– 31830
.18
Холл
AM
, Орлоу
SJ.
Деградация тирозиназы, индуцированная фенилтиомочевиной, происходит после созревания по методу Гольджи
. Разрешение пигментных ячеек
2005
; 18
: 122
– 129
.19
Парвез
С.
и др. Обзор и механизм действия депигментирующих и осветляющих средств для кожи
. Phytother Res
2006
; 20
( 11
): 921
– 923
.20
Флора
К.
и др. Расторопша пятнистая (Silybum marianum) для лечения заболеваний печени
. Am J Гастроэнтерол
1998
; 93
: 139
– 143
.21
Zi
X.
и др. Антиканцерогенный эффект флавоноидного антиоксиданта силимарина в клетках рака молочной железы человека MDA-MB 468 : индукция ареста G1 за счет повышения Cip1/p21, сопровождающегося снижением киназной активности циклинзависимых киназ и связанных с ними циклинов
. Clin Cancer Res
1998
; 4
: 1055
– 1064
.22
Кан
JS
и др. Защита от липополисахарид-индуцированного сепсиса и ингибирование синтеза интерлейкина-1β и простагландина Е2 силимарином
. Биохим Фармакол
2004
; 67
: 175
– 181
.23
Гу
М.
и др. Силибинин ингибирует воспалительные и ангиогенные признаки фотоканцерогенеза у бесшерстных мышей SKH-1
. Рак Res
2007
; 67
: 3483
– 3491
.24
Токлю
HZ
и др. Силимарин, антиоксидантный компонент Silybum marianum, предотвращает вызванное сепсисом острое повреждение легких и головного мозга
. J Surg Res
2008
; 145
: 214
– 222
.25
Бриганти
S.
и др. Химические и инструментальные методы лечения гиперпигментации
. Разрешение пигментных ячеек
2003
; 16
: 101
– 110
.26
Yokota
T.
и др. Ингибирующее действие глабриндина из экстрактов солодки на меланогенез и воспаление
. Разрешение пигментных ячеек
1998
; 11
: 355
– 361
.27
Lee
KK
, Чой
JD.
Действие экстракта ареки катеху L на противовоспалительное и антимеланогенное действие
. Int J Cosmet Sci
1999
; 21
: 275
– 284
.28
Хасегава
T.
и др. Биоактивные монотерпеновые гликозиды, конъюгированные с галловой кислотой из листьев Eucalyptus globulus
. Фитохимия
2008
; 69
: 747
– 753
.29
Парк
SH
и др. Террейн: новый ингибитор меланогенеза и его механизм
. Cell Mol Life Sci
2004
; 61
: 2878
– 2885
.30
Сато
К.
и др. Снижение экспрессии тирозиназы ацетилсалициловой кислотой при мышиной меланоме В16
. Биол Фарм Бык
2008
; 31
: 33
– 37
.31
Bennet
DC
, Lamoreux
ML.
Цветовые локусы мышей: генетический век
. Разрешение пигментных ячеек
2003
; 16
: 333
– 344
.32
Абдель-Малек
ZA
и др. In vitro модуляция пролиферации и меланизации клеток меланомы S91 простагландинами
. Рак Res
1987
; 47
: 3141
– 3146
.33
Скотт
Г.
и др. Воздействие PGF2α на меланоциты человека и регуляция FP-рецептора ультрафиолетовым излучением
. Exp Cell Res
2005
; 304
: 407
– 416
.34
Сасаки
С.
и др. Влияние простагландина F 2α и его аналогов на отрастание волос и фолликулярный меланогенез в мышиной модели
. Exp Dermatol
2005
; 14
: 323
– 328
.
2009 Королевское фармацевтическое общество Великобритании
Эта статья публикуется и распространяется на условиях издательства Oxford University Press, Standard Journals Publication Model (https://academic.oup.com/journals/pages/open_access/funder_policies/chorus/standard_publication_model)
Количественный анализ содержания меланина в трехмерной культуре клеток меланомы
Двухмерная монослойная культура меланоцитов и влияние обработки α-МСГ на меланоциты
Прежде чем исследовать продукцию меланина меланоцитами в трехмерной культуре, мы исследовали характеристики меланогенеза наши клеточные линии в обычной двумерной монослойной культуре. Клетки B16 представляют собой клеточные линии меланомы, полученные от мышей C57BL/6 22 , которые продуцируют меланин и проявляют метастатическое поведение.Таким образом, клетки B16 широко используются для изучения меланогенеза и депигментации 23 , метастазов опухолей 24 , а также для измерения цитотоксичности различных веществ на моделях кожи 25 . В 2D-культуре клетки B16 постепенно теряют способность синтезировать меланин по мере продолжения пересева 26,27 . Поэтому клетки должны быть пигментированы заранее, чтобы их можно было использовать для исследований депигментации; Альфа-меланоцитстимулирующий гормон (α-МСГ) является одним из наиболее часто используемых реагентов для лечения пигментации.Он активирует аденилатциклазу для повышения уровня циклического аденозинмонофосфата внутри меланоцитов, тем самым способствуя росту меланоцитов и индуцируя меланогенез 28,29 . Заменимая аминокислота L-тирозин, содержащаяся в большинстве сред для культивирования клеток, может стимулировать меланогенез гормоноподобным образом 30 ; однако эта стимуляция L-тирозином незначительна по сравнению со стимуляцией α-МСГ.
Ссылаясь на значения из предыдущих исследований, обычно используемые клеточные линии B16 B16F10 и B16F1 обрабатывали α-MSH в диапазоне от 10 до 50 нМ.После обработки α-МСГ форма клеток изменилась дендритно, а цвет клеточного осадка, который первоначально казался белым или серым, стал коричневым и черным, что указывает на синтез меланина (рис. 1А). Такие дендритные расширения меланоцитов, как известно, необходимы для переноса меланосом из меланоцитов в окружающие кератиноциты 31,32 . Лечение а-МСГ значительно ингибировало клеточную пролиферацию, а количество меланина не увеличивалось при повышении концентрации а-МСГ (рис.S1, дополнительная информация). Затем мы провели тот же эксперимент, используя более низкий диапазон концентраций α-MSH, от 0,001 до 10 нМ. В этом диапазоне как внутри-, так и внеклеточный меланин увеличивался дозозависимым образом как в клетках B16F10, так и в клетках B16F1 (рис. 1B, C). В случае клеток B16F1 уже 0,01 нМ α-MSH вызывали заметный уровень синтеза меланина. Полумаксимальную эффективную концентрацию (EC50) α-MSH для обеих клеточных линий рассчитывали в диапазоне от 100 до 400 пМ. Зигрист и др. .также сообщалось, что клетки B16F10 показали дозозависимое увеличение внеклеточного меланина, когда их обрабатывали α-МСГ в диапазоне концентраций от 0,001 до 1 нМ, с α-МСГ EC50 27 пМ 21 . Ингибирование роста клеток под действием α-MSH также наблюдалось дозозависимым образом (рис. 1D). Высокие концентрации α-МСГ (50–100 нМ) могут быть предпочтительными в исследованиях депигментации, чтобы продемонстрировать значительный эффект веществ-кандидатов без учета других эффектов, таких как ингибирование пролиферации.
Рисунок 1 Влияние обработки α-МСГ на синтез меланина и пролиферацию 2D-культивируемых меланоцитов. α-MSH-индуцированный синтез меланина в 2D-культивируемых клетках B16. ( A ) Обработка 10 нМ α-MSH в течение 72 часов индуцировала заметный меланогенез в обеих клеточных линиях. Наблюдалась типичная дендритная морфология и темная пигментация. Масштабная линейка = 200 мкм. Количество ( В ) внутриклеточного и ( С ) внеклеточного меланина продемонстрировало дозозависимый ответ в обеих клеточных линиях.( D ) Пролиферация клеток B16 ингибировалась обработкой α-MSH. Достоверную разницу анализировали с помощью t-критерия (*p < 0,05).
В то время как уровень внеклеточного меланина в контрольных меланоцитах без обработки α-МСГ был незначительным, количество измеренного внутриклеточного меланина было значительным (несколько пикограммов на клетку). Это подняло вопрос о том, связано ли полученное значение с внутриклеточным меланином или с другими клеточными веществами в лизате: когда мы измеряем поглощение осадка, мы измеряем весь лизат, который содержит разнообразный клеточный материал, включая белки и липиды.Мутность от этих компонентов может влиять на абсорбцию, поэтому количество меланина может быть завышено. Чтобы ответить на этот вопрос, мы измерили абсорбцию клеточного лизата из нескольких разных клеточных линий, не продуцирующих меланин. Большинство протестированных клеток показали уровень поглощения, аналогичный или более низкий, чем непигментированные клетки B16F10 и B16F1 (рис. S2, дополнительная информация), но одна протестированная линия (MCF7) показала значительный уровень поглощения. Мы предполагаем, что такое высокое поглощение MCF7 в основном связано с другим клеточным веществом, поскольку поглощение значительно уменьшалось после центрифугирования, в отличие от клеток B16.Когда мы измеряем относительные параметры, такие как EC50, фоновое поглощение клеточными веществами можно не учитывать. Однако при определении абсолютного количества меланина следует учитывать уровень фонового поглощения. Это явление можно преодолеть, используя стандартную кривую, подобную реальному образцу, например, выброс меланина в клеточный лизат. Мы также отмечаем, что для лучшей количественной оценки следует рассмотреть возможность использования природного меланина для построения стандартной кривой, поскольку калибровка с использованием синтетического меланина может привести к систематической погрешности измерения природного меланина в культуре.
Трехмерная культура меланоцитов и неинвазивное измерение меланина
В нашем исследовании мы создали агрегат клеток B16 методом висячей капли, как описано на рис. 2. Процесс образования и роста агрегата регистрировали по времени. замедленная съемка в реальном времени (рис. 3A и дополнительное видео). Первоначально клетки B16F10 были рассеяны в висящей капле, а затем постепенно перемещались к нижней стороне капли под действием силы тяжести. Адгезия между клетками прогрессировала, образуя агрегат примерно через 12 часов, после чего он непрерывно рос.Большинство клеток в совокупности оставались живыми через 72 часа в культуре (рис. 3B). Интересно, что когда мы перенесли агрегаты в чашку Петри для длительного культивирования в суспензии, культуральная среда приобрела темно-коричневый цвет через несколько дней даже без присутствия α-MSH, о чем также сообщается в другой литературе 33 . Поскольку добавление α-МСГ может влиять на клеточный статус (например, ингибирование пролиферации), такая спонтанная продукция меланина путем образования клеточной агрегации является очень привлекательной характеристикой.
Рисунок 2 Схематический обзор разработанного метода неинвазивного измерения внеклеточного меланина в 3D-культуре меланоцитов. (Этап 1) Меланоцитам дают возможность сформировать агрегат в виде висящей капли в течение 72 часов. (Этап 2) Агрегаты переносят в плоскодонный 96-луночный планшет ULA с добавлением или без добавления депигментирующих агентов. (Этап 3) Меланин, присутствующий в среде для культивирования клеток, контролируют путем измерения поглощения при 490 нм в течение 4 дней.
Рисунок 3 Трехмерная культура меланоцитов и их спонтанная продукция меланина.( A ) Клетки B16F10 образовывали единый агрегат в чашках с висячей каплей и ULA с круглым дном, но они образовывали несколько небольших агрегатов в плоскодонной чашке. ( B ) Окрашивание агрегата B16F10 в режиме «живой/мертвый» показывает, что большинство клеток остаются живыми после 72-часового культивирования в висячей капле. ( C ) Агрегаты меланоцитов в 3D-культуре продуцировали меланин без добавления гормонов, синтезирующих меланин. ( D ) Осадок агрегата меланоцитов продемонстрировал увеличение выработки меланина со временем.
Для высокопроизводительного скрининга 96-луночный формат предпочтительнее обычных культур в чашках или колбах. Во-первых, клетки, выращенные в 3D, могут легко достигать высокой плотности клеток. Кроме того, уровень внеклеточного меланина в 3D-культивированных клетках был достаточно высоким, чтобы его можно было обнаружить невооруженным глазом, а это означает, что мы можем измерить внеклеточный меланин, не разрушая клетки. Таким образом, трехмерная культура меланоцитов в формате 96-луночного планшета открывает возможность неинвазивного высокопроизводительного измерения меланина.С помощью этой культуры мы систематически исследовали образование агрегатов меланоцитов и количественно измеряли продукцию меланина.
Во-первых, мы протестировали различные начальные количества клеток для образования агрегатов. Клетки B16F10 со всеми протестированными исходными номерами клеток (500, 1000 и 2000) успешно сформировали агрегаты (рис. S3 (A), дополнительная информация). В то время как меланоциты с более высоким исходным числом клеток образовывали более крупный агрегат и продуцировали более высокие уровни меланина, среда в капле одновременно подкислялась быстрее.Таким образом, мы решили изначально использовать 1000 ячеек. Совокупность меланоцитов росла в виде листа толщиной в несколько сотен микрон, а не в виде сферического компакта, где поступление кислорода и питания ограничено. Следовательно, размер агрегатов B16 со временем непрерывно увеличивался без заметного замедления до 6 дней (рис. S3 (B), дополнительная информация). Через 72 часа средний диаметр агрегата составлял примерно 681 ± 28 мкм в случае клеток B16F10. Клетки B16F1 показали сходное поведение в процессе клеточной агрегации, но скорость роста была ниже, чем у клеток B16F10, что аналогично наблюдалось в 2D-культуре (данные не представлены).
Хотя метод висячей капли является эффективным и недорогим способом получения ячеистого агрегата, он имеет несколько ограничений. Длительное культивирование невозможно из-за небольшого объема капли, который обычно составляет 20–30 мкл. Капля также склонна к испарению и изменению рН, а промывка или обработка клеток реагентами в капле не является простой задачей. Поэтому мы перенесли агрегат в плоскодонный 96-луночный планшет со сверхнизким прикреплением (ULA) через 72 часа и продолжили культивирование в течение дополнительных 96 часов.Больший объем культуры (200–250 мкл) позволяет увеличить время культивирования, а формат планшета с лунками обеспечивает возможность высокопроизводительного скрининга. В тестах с использованием пластин ULA с самого начала (рис. 3A) в случае пластины с плоским дном было образовано несколько небольших агрегатов разного размера, которые не применимы к нашему анализу. Пластина с круглым дном подходила для получения заполнителя одинакового размера, однако форма дна пластины вызывала несколько проблем в других местах. Расположение агрегата в центре мешало измерению внеклеточного меланина, а плохая оптическая прозрачность не подходила для воспроизводимых измерений поглощения.Таким образом, сочетание метода висячей капли с суспензионной культурой в плоскодонной пластине ULA может быть наиболее эффективным способом культивирования меланоцитов в 3D и непрерывного измерения меланина в ходе культивирования.
Затем мы исследовали синтез и секрецию меланина агрегатами меланоцитов. Внеклеточный меланин измеряли с 24-часовыми интервалами (рис. 3C). Поскольку измерить количество клеток и объем культуры каждого трехмерного агрегата было невозможно, мы использовали отдельную шкалу для производства меланина трехмерного агрегата (мкг/лунку).Хотя изменение цвета культуральной среды не было заметно до 48 часов после переноса (PT) в 96-луночный планшет ULA, количество меланина на лунку со временем продолжало увеличиваться. Цвет гранул также со временем темнел, что указывает на активный синтез меланина (рис. 3D). Количество внеклеточного меланина также увеличивалось со временем, достигая 2,26 и 1,37 мкг на лунку из клеток B16F10 и B16F1, соответственно, через 96 часов по тихоокеанскому времени. Различия в значениях измерений между техническими четырехкратными повторениями были относительно небольшими, с относительным стандартным отклонением менее 15%.
Затем мы исследовали, вызывает ли добавление α-МСГ дальнейший меланогенез в меланоцитах. Количество внеклеточного меланина значительно увеличивалось дозозависимым образом с 48 часов по тихоокеанскому времени (рис. S4, дополнительная информация). Через 96 часов по тихоокеанскому времени внеклеточный меланин в клетках B16F10, обработанных 1 нМ α-MSH, был примерно в девять раз выше, чем в необработанных клетках. В случае клеток B16F1 усиление было гораздо более заметным, как мы также наблюдали в 2D-культуре. Хотя α-MSH может дополнительно индуцировать выработку меланина, агрегаты клеток B16F10 и B16F1 продуцировали достаточное количество меланина, чтобы его можно было обнаружить без стимуляции.Время культивирования, необходимое для накопления достаточного количества меланина, чтобы его можно было измерить, было одинаковым при лечении и без него. Более того, в нашем 2D-исследовании было обнаружено, что α-MSH ингибирует пролиферацию меланоцитов даже при низкой концентрации. Поэтому описанное ниже исследование депигментации проводилось без обработки α-МСГ.
Измерение эффектов депигментации в трехмерной культуре с помощью неинвазивной абсорбционной спектроскопии
Депигментирующие агенты в основном подразделяются на (1) вещества, участвующие в контроле процесса синтеза меланина (например,грамм. контролирующих количество или активность тирозиназы), (2) вещества, препятствующие перемещению или диспергированию меланосомы, которая представляет собой меланинсодержащую органеллу, и (3) вещества, способствующие обновлению клеток кожи 34,35 . Здесь мы протестировали три хорошо известных депигментирующих агента: арбутин, койевую кислоту и ниацинамид 36 . Арбутин представляет собой β-D-глюкопиранозид гидрохинона, который служит конкурентным ингибитором тирозиназы, ключевого фермента в пути меланогенеза, ингибирующего созревание меланосом.Койевая кислота (5-гидрокси-2-гидроксиметил-4H-пиран-4-он) представляет собой хелатор меди и один из наиболее интенсивно изучаемых ингибиторов тирозиназы. Ниацинамид (витамин В3, никотинамид, 3-пиридинкарбоксамид) представляет собой биологически активную форму никотиновой кислоты, которая препятствует переносу меланосомы от меланоцитов к кератиноцитам.
На основании опубликованных исследований по депигментации, в которых использовались депигментирующие агенты в диапазоне от 100 до 1000 мкМ 5,37,38,39 , мы выбрали концентрацию 500 мкМ, чтобы продемонстрировать разработанный тест, диапазон концентраций, который, как известно, не является цитотоксическим 40 .Депигментирующие агенты добавляли во время переноса агрегата меланоцитов в 96-луночный планшет. Мы отслеживали морфологию клеточных агрегатов (рис. S5, дополнительная информация) и уровень внеклеточного меланина (рис. 4). Не было никаких существенных различий в размере и морфологии агрегатов после обработки депигментирующими агентами, и обе клеточные линии показали схожую тенденцию к депигментации. Депигментирующий эффект арбутина и койевой кислоты проявлялся с 72 часов по тихоокеанскому времени и становился более очевидным через 96 часов по тихоокеанскому времени, при этом койевая кислота демонстрировала более выраженный эффект депигментации.Для упрощения сравнения между образцами мы определили индекс депигментации (DI) как процент снижения содержания меланина в обработанных образцах по сравнению с необработанным контролем, как описано в приведенном ниже уравнении, а данные приведены в таблице 1.
$${ \rm{Депигментация}}\,{\rm{индекс}}\,({\rm{DI}},\, \% )=\frac{Melani{n}_{необработанный}-Melani{n}_{ обработанные}}{Melani{n}_{обработанные}}\times 100$$
Рисунок 4 Депигментирующие эффекты арбутина, койевой кислоты и ниацинамида на меланоциты в 3D-культуре.Изменение продукции внеклеточного меланина во времени в клетках ( A ) B16F10 и ( B ) B16F1. Достоверную разницу анализировали с помощью t-критерия (*p < 0,05).
Таблица 1 Индекс депигментации арбутина, койевой кислоты и ниацинамида, полученный из 3D-культивируемых клеток B16. DI был несколько выше в клетках B16F10 в целом. Койевая кислота оказалась наиболее эффективным депигментирующим агентом среди протестированных веществ в концентрации 500 мкМ, что согласуется с предыдущим исследованием, в котором койевая кислота была более эффективной, чем арбутин, в концентрации 500 мкМ 38 .Ниацинамид не проявлял какого-либо депигментирующего действия: поскольку ниацинамид участвует в переносе меланосом в кератиноциты, известно, что он не оказывает депигментирующего действия в среде, в которой культивируются только меланоциты 31 . Интересно, что ниацинамид довольно значительно повышал уровень внеклеточного меланина после 72 часов ПТ.
Мы измерили внеклеточный меланин из сфероидного лизата в конце культивирования, чтобы сравнить разработанный метод с традиционным (рис.S6, дополнительная информация). Результат был схожим в том, что и арбутин, и койевая кислота проявляли депигментирующий эффект, а ниацинамид — нет. Однако при обычном измерении меланина арбутин оказался более эффективным, чем койевая кислота, а ниацинамид вообще не увеличивал внутриклеточную выработку меланина. Объяснение этого несоответствия выходит за рамки нашей текущей компетенции, но мы предлагаем учитывать потенциальные различия между внутри- и внеклеточными измерениями меланина.
Наконец, мы исследовали выработку меланина клеточными агрегатами B16 при обработке от 10 до 2000 мкМ каждого депигментирующего агента. В то время как арбутин не проявлял дозозависимого ответа на внеклеточный меланин, койевая кислота и ниацинамид проявляли его, хотя и в совершенно другом направлении, чем 72 часа по тихоокеанскому времени (рис. 5 и S7, дополнительная информация). Койевая кислота продемонстрировала типичную сигмоидальную дозозависимую реакцию, и рассчитанная EC50 для клеток B16F10 составила 115,8 ± 8,0 мкМ. Ниацинамид не влиял на выработку меланина в диапазоне от 10 до 200 мкМ, однако концентрации выше 500 мкМ индуцировали высокий уровень выработки меланина дозозависимым образом.Размер и морфология агрегатов B16 не менялись до 500 мкМ каждого депигментирующего агента (рис. S8, дополнительная информация). Однако при концентрациях выше 1000 мкМ агрегаты B16 были значительно меньше по размеру и имели более компактную морфологию. Поэтому для протестированных депигментирующих агентов в 3D-культивируемых клетках B16 рекомендуется концентрация ниже 500 мкМ. Рисунок 5( A ) Количество внеклеточного меланина существенно не менялось при различных концентрациях арбутина. ( B ) Койевая кислота показала типичную дозозависимую депигментацию. ( C ) Концентрации ниацинамида выше 500 мкМ значительно индуцировали выработку меланина.
Таким образом, мы разработали неинвазивный метод количественного определения меланина, основанный на трехмерной культуре клеток B16F10 и B16F1, который потенциально можно использовать для высокопроизводительного скрининга депигментирующих агентов.
